一、人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展(论文文献综述)
袁伟燕[1](2021)在《KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制》文中提出背景:生殖细胞是向下一代传递遗传和表观遗传信息的重要环节,生殖细胞的缺陷可导致不孕不育等疾病的发生。人类原始生殖细胞(human primordial germ cell,hPGC)特化是人类生殖和进化的基础,这一过程发生在囊胚着床后不久(约在孕2~3周),该时期胚胎组织获取困难,不利于体外研究的开展,hPGC的特化机制目前尚无报道。尽管人类原始生殖细胞样细胞(human primordial germ cell-like cell,hPGCLC)的体外诱导系统已经建立,可以相应呈现hPGC早期发育特征,然而hPGCLC的特化机制目前仍不清晰。目的:了解人类生殖细胞的发育和调控机制,对生殖生物学和临床相关疾病的研究具有理论指导意义。本研究拟通过探讨表观遗传因子与转录谱在人类原始生殖细胞样细胞的特化过程中的相关性,以揭示其分子调控机制,为理解体内原始生殖细胞发育及特化机制提供参考。方法:我们首先利用体外诱导体系从hES细胞系中诱导获得人类原始生殖细胞样细胞(hPGCLC),借助RNA-seq技术检测了 KDM2B在不同时间点hPGCLC中的动态表达。为了进一步探究KDM2B缺失对hESC自我更新或多能性的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具建立KDM2B敲除(Knock out,KO)的hES细胞系;通过QPCR及蛋白印迹检测KDM2B的敲除效果,核型分析实验检测KDM2B KO hES细胞系的核型。利用QPCR、免疫荧光、小鼠皮下畸胎瘤实验等,对敲除细胞系中干性基因的表达及向三胚层分化的能力等进行检测。另外,将体外培养的KDM2B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式细胞分选术分选不同时间点的拟胚体中的hPGCLCs,同时利用免疫荧光验证hPGCLC的分化效率。进一步通过转录组学分析寻找KDM2B KO hPGCLCs的特异性基因表达谱,为揭示hPGCLC基因表达的分子机制提供参考。其次,利用CRISPR/Cas9技术建立KDM5B KO hES细胞系,QPCR检测其多能性基因的表达。将体外培养的KDM5B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率。最后,利用四环素基因调控(TetOn)系统在KDM2B KO hESCs中建立Dox诱导外源性KDM2B稳定表达的hESC系。将重新表达KDM2B的hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率,通过回补实验验证KDM2B在hPGCLC特化中的作用。结果:我们发现,KDM2B在人类胎儿生殖细胞及体外诱导分化的hPGCLC中高表达,提示KDM2B可能在hPGCLC分化中发挥了作用。KDM2B KO hESCs与WT hESCs一样呈现紧密的圆形克隆形态,且均表达经典的多能性基因;并且,KDM2B KO hESCs与WT hESCs组一样也能形成具有三个胚层的畸胎瘤。表明KDM2B的缺失对hESC的干性维持和向三胚层分化的能力没有明显影响。将KDM2B KO hESCs与WT hESCs在4种激酶抑制剂(4i)中培养4天,并向hPGCLC诱导分化6天,发现KDM2B KO组中hPGCLC的分化效率在向hPGCLC诱导的第二天开始显着降低,KDM2B的耗竭显着损害了原始生殖细胞样细胞的分化,表明KDM2B在hESC向hPGCLC的特化过程中发挥了重要作用。转录组数据显示,在hPGCLC特化过程中,与hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的生殖细胞基因不同,KDM2B敲除的hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的为心脏形态发生的中胚层基因,且内胚层基因GATA5也出现上调,提示缺失KDM2B细胞在诱导为hPGCLCs第一天时已经发生体细胞分化。因此,我们推测KDM2B在hPGCLC特化的过程中可能发挥了抑制体细胞基因表达进而抑制其向体细胞方向转变的作用。值得注意的是,一些表观遗传调控因子如KDM5B、TET1在WT Day 2hPGCLCs中显着上调,而在KDM2B KO Day 2hPGCLCs中这些基因并没有转录激活,说明KDM2B的缺失影响了hPGCLC特化过程中的表观遗传学特征,而DNA甲基化失调可导致靶基因的转录异常,KDM2B的缺失导致一些表观遗传因子的改变,可能影响了 hPGCLC发育过程中细胞命运的决定。我们的数据显示,敲除KDM2B的hESC中H3K4me3的另一个去甲基化酶KDM5B的表达上调,提示可能是KDM2B缺失后的补偿效应。然而我们构建了KDM5B KO hES细胞系并将其向hPGCLCs方向分化,发现缺失KDM5B组hPGCLCs的分化效率与WT组无明显差异,说明KDM5B对于hPGCLC的特化并非不可或缺。最后,我们利用Tet-On诱导基因表达系统在KDM2B KO hESCs中建立受四环素(Doxycycline,Dox)调控稳定表达KDM2B的hES细胞系,将KDM2B的表达激活到内源性水平,发现加Dox表达KDM2B组的拟胚体中hPGCLCs的分化效率明显增高。结果说明通过外源性表达KDM2B可以修复由于缺失KDM2B引起的hPGCLC分化受损,进一步验证了 KDM2B的表达是hPGCLC特化的重要因素之一。结论:本研究发现虽然缺失KDM2B对人胚胎干细胞的干性维持和三胚层分化的潜能没有明显影响,但KDM2B的耗竭显着损害了 hPGCLCs的特化,而外源性表达KDM2B能有效地挽救这种损害,表明缺失KDM2B损害了生殖细胞特化。转录组结果表明,在hPGCLC特化过程中,KDM2B通过抑制体细胞基因的表达,进而抑制其向体细胞方向转变的作用。本研究表明,KDM2B是hPGCLC特化不可缺少的表观遗传调控因子,为研究表观遗传调控如何协调hPGC发育中的转录事件提供了一个新的角度。
尹姝媛[2](2020)在《猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究》文中指出目前已经有很多关于猪多能性干细胞的报道,但尚未获得有效的培养体系可以支持干细胞长时间稳定传代并实现生殖嵌合。胚胎质量和培养体系对胚胎干细胞的成功构建都具有重要意义。早期胚胎发育需要核心转录因子和相关信号通路共同发挥作用,而胚胎干细胞建立的过程相当于在体外添加化合物和细胞因子维持内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)的多能性并提供营养物质维持其生长和增殖的过程。因此,本研究根据各阶段胚胎测序数据筛选出调控ICM发育相关通路的激活剂,再通过在猪早期胚胎体外培养液和胚胎干细胞培养液中添加该类小分子,最终确定其对猪早期胚胎质量和胚胎干细胞多能性的影响,主要结果如下:1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路,结果表明:ICM形成过程中,WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子,筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。2.组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明:囊胚率(49.23±8.40%v.s.32.34±4.15%,P<0.05)、囊胚孵化率(16.19±1.96%v.s.10.25±1.12%,P<0.05)、ICM细胞数(7.72±2.30 v.s.4.28±1.60,P<0.01)提高,多能性基因OCT4(P<0.01)、SOX2(P<0.01)和NANOG(P<0.05)以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外,此体系显着提高胚胎干细胞建系效率(KOFL体系:34.70±4.77%v.s.25.12±2.10%,P<0.05;LCDMIV体系:37.82±2.56%v.s.25.26±3.18%,P<0.01)。3.用体外受精胚胎验证组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率(28.47±2.16%v.s.19.65±4.02%,P<0.05)、ICM细胞数(6.60±1.50 v.s.4.50±0.89,P<0.01)、囊胚孵化率(12.03±1.73%v.s.7.27±0.79%,P<0.05),及OCT4(P<0.01)、SOX2(P<0.05)和NANOG(P<0.01)的表达。4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明:LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持,提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达;在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力,细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明:pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代,多能性基因OCT4(P<0.05)、SOX2(P<0.01)和NANOG(P<0.01)相对于pPSCs-KOFL的表达更高,细胞可传15代以上;pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系,细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性,且具有分化为三胚层的能力;KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin,维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系,两个体系均可支持从头建系,多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高,但OCT4激活受限,细胞多能性部分提高。6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路,结果表明:LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAKSTAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达,F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达,参与调控细胞多能性。以上结果表明,WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中,添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系,有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的胚胎干细胞系。
祝振硕[3](2020)在《OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制》文中指出猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显着下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显着升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显着下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞(Feeder free,F-)时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX(Feeder and DOX free,FD-)会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因(OCT4/SOX2)整体蛋白水平也显着下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显着升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显着上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显着降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显着影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS)来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。
伟人悦[4](2020)在《猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究》文中研究说明心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是目前全球范围内导致患者死亡的最主要因素之一。冠状动脉类疾病(coronary artery disease,CAD)是心血管疾病中的一种,其致病机理为:由于血管内皮功能障碍引发血管损伤或血管功能丧失,造成心脏的血液灌注减少,最终引发心肌缺血甚至心肌梗塞。但是传统的药物针对该类疾病的治疗具有很大局限性,因此细胞移植治疗成为相关医疗及科研人员的关注点。胚胎干细胞(embryo stem cell,ESCs)和诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell,i PSCs)是细胞移植治疗的种子细胞来源。但是ESCs的临床应用涉及到医学伦理问题和异体移植后的免疫排斥风险,i PSCs的应用将为心血管疾病的治疗提供便利。目前,很多研究人员对i PSCs向血管内皮细胞的定向分化进行了探索,相关研究主要集中在小鼠和人上。猪作为一种重要的农用家畜,其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性,猪的寿命又相对较长,因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型。对于猪诱导多能性干细胞的建系、培养及定向分化为血管内皮细胞体系的研究将为创建猪心血管疾病模型提供保障。目前,很多研究组通过不同的方法建立了猪i PS细胞系,但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究少之又少。2013年,Gu等首次报道了将猪脂肪间充质来源的i PSCs诱导分化为内皮细胞的方法,但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径,培养液成分也相对复杂。针对上述问题,我们进行了以下四部分研究:(1)使用无血清单层细胞诱导的方式对四种猪多能性干细胞系(猪胚胎来源的干细胞系Penk6和Pe WCHX,猪诱导多能性干细胞系Pilw4和M10)进行诱导分化,并检测细胞分化前期谱系特异性基因的表达趋势,从而筛选出中胚层分化潜能最高的猪多能性干细胞系;(2)使用不同的细胞因子或化学小分子组合对上述细胞进行诱导,筛选出促进细胞向中胚层分化的最优组合;(3)优化上述培养体系,建立一种无血清无饲养层的猪i PSCs向血管内皮细胞定向分化的诱导方法;(4)使用上述方法分别诱导人和猪的多能性干细胞向内皮细胞分化,并比较二者分化进程中的差异。研究结果表明,猪胚胎来源的Penk6和Pe WCHX细胞系在诱导分化过程中细胞形态无明显变化,猪诱导多能性干细胞M10和Pilw4在诱导分化过程中失去克隆形态并有部分细胞死亡。谱系特异性基因的表达检测结果显示,Penk6、Pe WCHX和M10细胞没有启动向原条期的分化且中胚层标记基因的表达变化无规律,Pilw4细胞的原条期、内胚层以及中胚层标记基因的表达水平均是先提高后下降,说明该细胞启动了分化进程。据此,我们选择猪诱导多能性干细胞系Pilw4进行后续实验。首先,我们使用四种前人报道的诱导人ESCs向血管内皮细胞分化的单层培养方法对pi PSCs进行定向诱导,在其中选择能够有效促进pi PSCs向中胚层分化的方法用于后续实验。接下来,我们对上述方法进行优化并研究了CHIR99201和BMP4在诱导分化前期的作用。实验根据第0至4天的不同处理方案分为6组进行:F,在第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2;FB,第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2和BMP4;BFB,第0至2天添加BMP4、第3至4天FGF2和BMP4;CF,在0至2天添加CHIR99201、3至4天添加FGF2;CFB,在0至2天添加CHIR99201,第3至4天添加FGF2和BMP4;CBFB,在第0至4天添加CHIR99021和BMP4,第3至4天添加FGF2和BMP4。上述6组从第5天开始处理一致:第5至7天培养液中添加VEGF和BMP4,8至10天换用商品化的内皮细胞培养液进行培养,第11天对细胞进行流式分选以及血管内皮细胞鉴定。实验结果显示,F、FB、BFB三组在诱导分化前期原条期标记基因的表达水平很低,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比仅为3.12%-5.16%;CF、CFB、CBFB三组在诱导分化前期原条期和内胚层标记基因的表达水平先上升后下降,中胚层标记基因表达水平持续上升,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比均高于12%,其中实验组CFB,CBFB的CD31阳性细胞率分别为21.3%和17.1%。以上结果表明,CHIR99201在pi PSCs向血管内皮细胞分化的前期具有促进作用,在诱导分化中期添加BMP4能够显着提高血管内皮细胞的诱导效率。此后,我们利用优化后的诱导步骤,从pi PSCs中获得了血管内皮细胞,该细胞具有与猪主动脉血管内皮细胞(AOCs)相似的形态、基因表达模式和功能特征。此外,我们使用相同的诱导步骤对人胚胎来源的干细胞进行诱导分化,结果表明人胚胎干细胞的分化效率远低于pi PSCs的分化效率,这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关。综上所述,我们建立了一种无血清的不依赖于饲养层的单层细胞诱导分化方法,可以将猪诱导多能性干细胞定向分化为具有功能的血管内皮细胞。该研究为评价大动物体内血管内皮细胞自体移植效果以及创建猪心血管疾病模型提供了可能。
吴爽[5](2020)在《TGF-β信号通路对猪类胚胎干细胞PeNK6多能性的影响》文中研究说明胚胎干细胞是一类来源于早期胚胎,在体外培养条件下具有自我更新和多向分化潜能的细胞。无限增殖和分化形成成体各类组织细胞的能力使其受到再生医学等领域的广泛关注。1981年Evans和Martin等人从小鼠胚胎中成功分离第一株小鼠胚胎干细胞,多年之后人、猴子和大鼠等不同物种的胚胎干细胞也相继成功建立。猪是一种重要的家畜,其在生理、解剖结构和免疫等方面与人有很大的相似性,建立猪胚胎干细胞也受到了广泛关注。过去的30多年间虽然有很多猪胚胎干细胞系被建立,但以生殖系嵌合发育能力为判定标准进行衡量,那么猪胚胎干细胞建系工作目前仍未成功。PeNK6细胞系是本实验室建立的猪早期胚胎来源的多能干细胞系,该细胞有着类似人胚胎干细胞的特征,呈扁平样克隆、表达核心转录因子,体内体外分化实验均可以获得典型的三胚层组织。Pe NK6细胞系中多能性相关信号通路如LIF/STAT3、FGF、WNT和PI3K等的激活情况在实验室前期工作中已被阐明,但关于TGF-β信号的激活情况和作用却尚未得到充分的研究。TGF-β信号通路在小鼠和人胚胎干细胞多能性维持中发挥着重要的作用,但在大型家畜胚胎来源干细胞中的作用仍存在争议。在猪早期胚胎来源干细胞中系统性地阐明TGF-β信号通路与多能性调控关系的报道很少,因此有必要深入地研究猪多能性干细胞中TGF-β信号通路在多能性调控中的作用。在本研究中我们通过单细胞测序和免疫蛋白印迹方法证明了TGF-β信号通路在Pe NK6细胞系中呈激活状态。对猪早期胚胎不同发育阶段RNA-Seq数据的分析发现,猪早期囊胚内细胞团中TGF-β信号通路活性较低,而发育至晚期囊胚其活性则逐渐上调。据此,我们推测在Pe NK6中抑制TGF-β信号可能会对Pe NK6细胞系的多能性有积极影响。因此本次研究通过在Pe NK6细胞系的培养体系(KO培养液)中添加小分子抑制剂SB431542和A83-01抑制TGF-β信号通路活性,检测Pe NK6细胞系的各类生物学指标的变化,从而评判TGF-β信号通路对Pe NK6细胞系生物学特征的影响。研究结果表明,TGF-β信号被抑制后,PeNK6的核心转录因子SOX2和初始态多能性相关因子KLF4,KLF5和TFCP2L1显着上调。同时激发态多能性因子DNMT3B显着下调,这表明抑制TGF-β信号通路后Pe NK6的多能性特征发生改变,表现为部分多能性基因表达模式由激发态转变为类似初始态。同时,抑制TGF-β信号通路对PeNK6细胞系的分化能力也产生影响。抑制TGF-β信号通路后,Pe NK6细胞系的拟胚体形成能力增强;拟胚体(Embryoid body,EB)尺寸和直径均显着提高。在相同的诱导分化条件下,抑制TGF-β信号通路条件下形成的EB中三胚层标记物表达水平整体低于对照组。以上结果表明,抑制TGF-β信号通路能够改善分化条件下猪类胚胎干细胞拟胚体的形成能力。另外,本次研究在TGF-β信号通路抑制培养体系KO+SB/KO+A中,利用5.5天的猪体外受精胚胎建立了新的多能性干细胞系。该细胞系在多能性因子表达模式上与Pe NK6细胞系在TGF-β通路抑制后具有较高的相似性,体外分化形成EB的能力优于Pe NK6,这进一步证实了抑制TGF-β信号通路对猪胚胎干细胞多能性具有积极影响。综上所述,本次研究结果表明,TGF-β信号通路在猪多能性干细胞中具有重要的生物学作用,抑制该信号通路对猪多能性干细胞的多能性相关特征具有正向影响。本次研究为深入理解TGF-β信号通路在猪胚胎干细胞多能性调控中的作用提供了详实的实验证据,对于建立具有生殖系嵌合发育能力的猪初始态胚胎干细胞系具有重要的参考价值。
李妍[6](2020)在《猪胚胎干细胞与多能性信号通路关系的研究》文中认为猪的饲养和繁殖较为便捷,在生理结构、形态学和免疫学上与人有着诸多类似的特性。所以猪胚胎干细胞的获得具有重要的意义。但是在小鼠和人胚胎干细胞成功建系后的十几年里,依然没有获得真正意义上的猪胚胎干细胞系。其中重要原因之一在于没有明确最适合的体外培养环境。胚胎干细胞体外多能性及自我更新能力的维持主要依赖于多能性信号通路的调控。已知小鼠胚胎干细胞(na?ve状态)主要依赖LIF/STAT3信号通路,人胚胎干细胞(primed状态)依赖FGF/ERK和TGFβ/Activin/Nodal信号通路。而大鼠等啮齿类动物可以通过抑制FGF/ERK信号通路和WNT信号通路中的GSK3β建立na?ve胚胎干细胞系。在此过程中可以削弱细胞对LIF信号通路的依赖。由此可以发现胚胎干细胞的建立和多能性维持主要依赖这几条信号通路的调控。而猪胚胎干细胞与这些信号通路的关系可能与小鼠胚胎干细胞和人胚胎存在差异,并且它们对猪胚胎干细胞的调控作用尚不清楚。本文主要以实验室现有猪类胚胎干细胞为研究对象,参照猪早期囊胚及两种细胞系的RNA-Seq测序数据,对上述几条多能性相关信号通路的关键因子的表达分别进行比较分析,得出结论后对干细胞系中的信号通路分别进行抑制或激活,从而明确这些信号通路与猪胚胎干细胞多能性状态的关系。我们分别对LIF/JAK/STAT3,FGF/MEK/ERK,TGFβ/Activin/Nodal及WNT/β-catenin信号通路进行了比较分析最终得出以下结果:(1)RNA-Seq测序数据显示猪早期囊胚ICM中特异性表达STAT3,并且通过免疫荧光的染色证实了猪早期囊胚ICM中STAT3特异性表达并激活,然而对猪类胚胎干细胞LIF/JAK/STAT3信号通路激活的实验中发现,利用LIF或IL-6无法激活现有猪类胚胎干细胞中LIF/JAK/STAT3信号通路,同时JAK/STAT3信号通路对于现有猪类胚胎干细胞的多能性维持是非必需的。应用这两个激活剂重新建系也只能获得KO样猪类胚胎干细胞系。表明在现有体系下所获的猪类胚胎干细胞系并不依赖LIF/JAK/STAT3信号通路,并且单纯的利用JAK/STAT3的激活剂也很难使细胞重编程到na?ve干细胞的状态。(2)RNA-Seq测序数据显示猪类胚胎干细胞中FGF/MEK/ERK信号通路的表达模式基本与ICM类似。由此我们推断FGF/MEK/ERK信号通路的激活是维持猪胚胎干细胞多能性的关键因素。结果证实了在猪胚胎干细胞建系的过程中离不开b FGF的添加,但是b FGF的持续添加会导致胚胎干细胞表达着床后囊胚阶段特定表达的maker基因。(3)RNA-Seq测序数据显示猪类胚胎干细胞相对于早期囊胚特异性高表达TGF-β/Activin/Nodal信号通路相关基因,这说明了在猪胚胎干细胞建系的过程中抑制这条信号通路可能是获得na?ve状态胚胎干细胞的重要因素。我们利用TGF-β/Activin/Nodal信号通路的小分子抑制剂可以改善猪类胚胎干细胞的多能性状态。(4)RNA-Seq测序数据显示,相对于猪类胚胎干细胞,WNT信号通路靶基因TCF3在ICM中特异性表达,由此我们推断WNT信号通路的激活可能是维持猪胚胎干细胞多能性的关键因素。但是在研究中发现猪类胚胎干细胞中β-catenin蛋白在细胞质中积累,而不是入核去激活WNT/TCF信号通路,来增强细胞活性同时改善细胞多能性状态。虽然我们没用单独的通过对一条信号通路抑制或激活而获得na?ve状态的猪胚胎干细胞系,但是也进一步明确了这些多能性相关信号通路与猪胚胎干细胞的关系。维持多能性状态的信号通路应该是一个网络调控结构,而这几条信号通路在干细胞中的作用也是交互的。我们的研究发现在建系的过程中添加b FGF能促进细胞初代克隆的形成,但是又会促使primed状态干细胞的衍生,利用TGF-β/Activin/Nodal信号通路的抑制剂SB431542,可以使细胞更接近na?ve状态,但是所获的细胞系在细胞生长能力方面没有明显的改善,而对于WNT信号通路的研究恰好补偿了这一缺陷。因此我们的研究为最终获得猪na?ve胚胎干细胞的培养条件奠定了基础,同时为获得na?ve细胞系提供了新的建系思路。
贾艳妮[7](2019)在《人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究》文中指出研究目的外伤、手术、眼内炎等多种因素均可造成角膜内皮细胞的损伤或丧失,由于人角膜内皮细胞不能再生,内皮细胞的缺失超过其临界值时,将会导致角膜内皮功能失代偿,出现角膜水肿、视物模糊和眼部刺激等症状,严重者继发角膜溃疡。目前临床治疗主要依赖角膜移植,但角膜供体的缺乏严重限制了手术开展和患者复明。随着组织工程和细胞工程技术的不断发展,组织工程角膜的研究也取得一定进展,组织工程角膜内皮是当前研究的热点。人胚胎干细胞是组织工程角膜内皮种子细胞的理想来源,但目前存在诱导时间长、效率低、移植手术要求高、体内功能差、细胞存活期短等问题。本研究改良了角膜内皮细胞的移植方法,通过制备迷你植片进行前房注射;采用小分子维甲酸(retinoic acid,RA)、Y-27632和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)分化为角膜内皮样细胞,建立了hESC来源的角膜内皮样细胞定向分化体系;利用新西兰大白兔和食蟹猴角膜内皮失代偿动物模型,结合迷你植片前房注射移植方法,验证hESC来源的角膜内皮样细胞体内功能,为临床治疗角膜内皮功能失代偿提供新的策略和方法。研究方法1.角膜内皮迷你植片的制备和移植通过单细胞前房注射法与角膜后弹力层剥除内皮移植术(Descemet’s Stripping Endothelial Keratoplasty,DSEK)行兔原代角膜内皮细胞(Rabbit Corneal Endothelial Cells,RCECs)移植,通过裂隙灯显微镜观察对比术后效果;利用不同的细胞消化酶(Accutase、胰蛋白酶-EDTA或Dispase)处理原代培养的兔角膜内皮细胞,通过对比植片大小、细胞存活率优化迷你植片制备条件;对比迷你植片与单细胞的贴附能力、细胞链接形成能力以及术后角膜透明度和厚度恢复情况。2.体外诱导hESC分化为角膜内皮样细胞hESC在mTeSRTM1培养基中培养传代,采用添加RA+bFGF的UM培养液诱导hESC向神经嵴细胞分化,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测,对hESC来源神经嵴细胞进行鉴定;采用添加Y-27632的DP培养液诱导分化为角膜内皮细胞,通过免疫荧光染色、流式细胞仪检测和PCR检测,对hESC来源的角膜内皮样细胞进行鉴定;通过NOD/SCID免疫缺陷鼠接种评估hESC来源的角膜内皮样细胞的安全性。3.hESC来源的角膜内皮样细胞移植功能鉴定将诱导的角膜内皮样细胞制备成迷你植片,通过前房注射法移植于新西兰大白兔右眼,以单纯刮除角膜内皮细胞的实验兔作为对照组。术后采用裂隙灯显微镜和超声测厚仪观察角膜及测量角膜厚度,比较两组角膜透明度和角膜厚度的恢复情况。使用活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察不同时间点移植细胞的形态。细胞移植术后不同时间点取材,通过免疫荧光染色观察移植细胞的紧密链接情况及内皮泵功能,利用地高辛标记细胞观察移植细胞的存活情况。同时采用迷你植片前房注射法移植于角膜内皮功能失代偿的食蟹猴模型,术后通过裂隙灯显微镜观察角膜透明度的恢复情况,采用超声测厚仪观察角膜厚度的变化情况,活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察移植内皮细胞的形态。诱导的角膜内皮样细胞移植术后取材行免疫荧光染色观察移植细胞在后弹力层的贴附存活情况及细胞紧密链接和内皮泵功能。研究结果1.角膜内皮细胞移植方法比较(1)单细胞前房注射法与DSEK法移植细胞的结果对比单细胞前房注射法与DSEK法行培养的兔原代角膜细胞移植术后角膜水肿消退的速度无明显差异。单细胞前房注射后角膜水肿逐渐消退,角膜恢复透明并维持稳定。DSEK法移植的角膜植片在术后早期有贴附不良现象,可见少量层间积液,角膜水肿消退后,植片可见部分混浊。(2)不同消化酶对兔原代角膜内皮细胞的影响Dispase消化能力过弱,细胞主要解离成大片状细胞植片。胰蛋白酶-EDTA消化能力过强,细胞迅速解离成单细胞。Accutase消化能力适中,细胞主要解离成含有4-10个细胞的细胞植片,并且随着消化时间的延长,植片形态变化不大。10分钟内Acutase或胰蛋白酶-EDTA对离体细胞消化损伤较小,细胞活力接近或超过90%,15分钟后两种消化酶解离的细胞存活率显着下降。(3)迷你植片移植动物实验迷你植片和单细胞悬液体外1小时及移植6小时后贴壁情况对比可见迷你植片组贴壁的细胞数目明显高于单细胞组。前房注射后48小时取材免疫荧光染色显示迷你植片组紧密链接蛋白ZO-1和内皮泵Na+/K+-ATPase表达量高于单细胞组。术后活体共焦角膜显微镜扫描显示迷你植片组术后7天角膜内皮细胞可见明显的六边形细胞形态,细胞之间链接紧密,而单细胞组术后7-21天之间细胞形态不规则,细胞之间未见正常的结构链接。迷你植片组比单细胞组具有更高的细胞密度。裂隙灯显微镜观察显示迷你植片组角膜透明度在术后7天迅速恢复,而单细胞组在术后14天逐渐恢复。术后角膜厚度测量结果显示迷你植片组术后7天角膜厚度迅速下降并保持稳定,而单细胞组术后14天角膜厚度逐渐下降至近正常水平。2.建立hESC来源的角膜内皮样细胞定向分化的方法(1)体外诱导人胚胎干细胞分化为神经嵴细胞hESC经诱导后形态逐渐发生变化,表现为干细胞克隆内细胞体积变大,核质比变小,细胞形态逐渐变为多角形。免疫荧光染色显示诱导的细胞表达神经嵴细胞标志基因(HNK-1、P75、SOX10、PITX2和AP-2α);流式细胞仪检测P75和HNK-1显示阳性细胞比率达到84.733%和72.993%。(2)体外诱导神经嵴细胞分化为角膜内皮样细胞在分化培养基中的神经嵴细胞形态发生变化,细胞呈多边形,排列紧密成铺路石样形态。免疫荧光染色显示该细胞表达角膜内皮细胞标志性基因(ZO-1、Na+/K+-ATPase和N-cadherin),不表达血管内皮细胞相关标志物(vWF和CD31)。流式细胞仪检测Na+/K+-ATPase显示阳性细胞比率达到98.090%。(3)分化细胞的致瘤性胚胎干细胞接种NOD/SCID免疫缺陷鼠5到6周后可见皮下包块形成,取材行石蜡切片染色可见多胚层组织细胞形态。诱导的角膜内皮样细胞接种免疫缺陷鼠观察8月后仍未见肿物形成。3.hESC来源的角膜内皮样细胞动物体内治疗效果(1)hESC来源的角膜内皮样细胞在新西兰大白兔模型的移植治疗效果裂隙灯显微镜观察显示移植细胞组兔角膜透明度在术后7天开始逐渐恢复,术后2周角膜基本恢复透明。术后观察4到8周角膜透明度维持稳定未见反复。对照组角膜术后混浊明显,至术后8周角膜仍未恢复透明。移植细胞组术后7天角膜厚度逐渐下降并在2-3周内恢复至正常厚度,而对照组术后角膜厚度下降不明显,长期保持在1000μm左右。活体共焦角膜显微镜扫描显示术后2周移植细胞组角膜中央区后弹力层贴附细胞直径明显小于正常角膜内皮细胞,细胞密度高,细胞六边形形态不典型,细胞之间未见明显链接形成。术后5周扫描显示细胞直径与正常角膜内皮细胞相比略大,部分细胞可见类似六边形形态,细胞之间可见链接形成。术后8周扫描显示细胞形态及大小与术后5周基本类似,细胞形态维持稳定。术后1周免疫荧光染色可见后弹力层贴附细胞抗人抗体染色阳性,移植细胞可见明显ZO-1及Na+/K+-ATPase的表达。术后4周取材移植地高辛标记细胞的角膜行荧光显微镜观察可见角膜中央区域大量红色荧光的移植细胞。(2)hESC来源的角膜内皮样细胞在食蟹猴模型的移植治疗效果裂隙灯显微镜观察显示角膜透明度在细胞移植术后7天逐渐恢复,可见清晰的瞳孔轮廓。术后2周角膜基本恢复透明,虹膜纹理清晰可见。角膜厚度测量显示细胞移植术后14天内角膜厚度逐渐下降至基本正常。活体共焦角膜显微镜扫描结果显示,术后11天角膜中央区后弹力层贴附的细胞直径明显小于正常角膜内皮细胞,细胞未见明显六边形形态,细胞之间未见明显链接形成。术后25天细胞形态与术后11天基本相似,但细胞形态逐渐趋向于规则。术后43天可见细胞大小与正常角膜内皮细胞相近,部分细胞可见类似六边形形态,细胞之间可见链接形成。术后60天扫描可见细胞形态及大小与术后43天类似,细胞形态维持稳定。术后3天取材行免疫荧光染色可见抗人抗体染色阳性的细胞贴附于角膜后弹力层,部分细胞表达Na+/K+-ATPase及SLC4A11。研究结论1.采用Accutase细胞消化液制备角膜内皮迷你植片,通过前房注射法进行移植能够促进移植细胞快速贴壁,加速移植细胞紧密链接的形成,从而发挥其屏障功能和泵水功能。2.采用小分子RA、Y-27632和细胞因子bFGF分两步将hESC诱导分化为神经嵴细胞,再进一步分化为角膜内皮样细胞,模拟了角膜内皮细胞的体内发育过程;3.hESC来源角膜内皮样细胞移植于角膜内皮功能失代偿新西兰大白兔和食蟹猴动物模型中,能够促进角膜水肿消退和角膜透明度恢复,移植细胞能够在体内长期存活并发挥内皮泵功能。创新和意义1.结合传统角膜内皮移植术和前房细胞注射法的优点,制备迷你植片前房注射移植角膜内皮细胞,促进移植细胞贴壁及发挥功能,改良了角膜内皮细胞移植的手术方式。2.首次采用小分子RA、Y-27632和细胞因子bFGF,模拟角膜内皮细胞的体内发育过程,快速有效地诱导hESC分化为神经嵴细胞和角膜内皮样细胞,为获取组织工程角膜内皮细胞提供了新的方法。3.首次将hESC诱导的角膜内皮样细胞在大动物食蟹猴模型中验证其角膜内皮细胞功能,为临床治疗角膜内皮功能失代偿提供新的方案。
王晨宇[8](2019)在《猪naive-like胚胎干细胞的鉴定及体外定向诱导分化的研究》文中研究指明研究背景:Naive状态的胚胎干细胞一直被研究者们认为是真正的胚胎干细胞,然而迄今为止,有蹄类大动物的naive胚胎干细胞始终未能成功建系。最新研究表明,利用携带转录因子的慢病毒载体转染猪的囊胚内细胞团,然后将内细胞团接种于含2i(CHIR99021和PD0325901)的LIF培养液中,可以获得猪类naive胚胎干细胞,然而这样获得的猪类naive胚胎干细胞由于来源于可能携带不同拷贝外源转录因子的不同的卵裂球,而不具有均一性。本实验室此前将经典的鼠源多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(mOSKM)表达载体通过核转染技术转入猪胎儿成纤维细胞(PEF),再通过体细胞克隆技术获得胚胎,并将其内细胞团接种于含3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的LIF培养液中,成功建立了猪naive-like胚胎干细胞系,但尚未对所建细胞系的内外源转录因子的表达进行较为系统的研究。目前关于猪多潜能干细胞定向分化为神经细胞鲜有报道,猪多潜能干细胞体外诱导神经细胞的分化缺少相关文献支持,因而尚无确切的猪胚胎干细胞定向分化诱导为神经细胞的方法。此外,猪类胚胎干细胞体外诱导分化为中胚层的方法尚无确定的标准,关于人和鼠胚胎干细胞向中胚层谱系类肾细胞分化的研究方法主要有特定诱导因子定向诱导分化、肾细胞共培养诱导胚胎干细胞分化和经拟胚体途径定向分化等策略。本研究利用本实验室所建立的猪naive-like胚胎干细胞系,在对其干细胞特性进行进一步鉴定和验证的基础上,研究了外源转录因子对内源Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc启动表达的影响及猪naive-like胚胎干细胞体外定向分化的能力,为获得主要内源转录因子全面启动的猪胚胎干细胞以及猪多能干细胞体外定向分化方法的建立提供参考。研究目的:鉴定猪naive-like多能干细胞内外源多能基因的表达情况;研究猪naive-like胚胎干细胞向外胚层谱系神经前体细胞和中胚层谱系肾前体细胞分化的能力。研究方法:对已建立的猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,并通过Q-PCR和免疫荧光染色鉴定细胞系特征;所建立的1、4号细胞系经去除DOX培养后,提取细胞系总RNA,反转录为cDNA,设计Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc引物进行RT-PCR后切胶回收,转化涂板挑克隆后送测序,通过对比内外源克隆占比了解细胞系在去除DOX培养后内外源基因的表达变化程度;利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性,通过Western Blot和细胞免疫荧光检测神经标志物Nf-l、βIII-Tubulin的表达水平;利用小分子BMP4、Activin A、CHIR99021、FGF9、Herparin和RA,采用三步法,获得肾前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行肾特异性基因表达鉴定,并通过Western Blot和免疫荧光检测肾细胞标志物WT-1的表达量。研究结果:对猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,结果显示Oct4、Sox2在细胞中基因高表达,通过Q-PCR证明naive-like状态的细胞与primed状态相比Xist基因表达要低,且在雌性细胞系中,通过细胞免疫荧光发现primed状态的有巴氏小体存在,而naive-like状态的几乎没有巴氏小体存在,证明获得的naive-like ESCs更趋近于naive状态;去除DOX培养1号和4号猪naive-like胚胎干细胞系,通过TA克隆测序发现1号细胞系在去除DOX之前内源OSKM四个转录因子均有所表达,内源表达量分别占总表达量的3.2%、35.0%、9.4%和9.5%,去除DOX后,内源Sox2和c-Myc的表达分别提高至78.3%和21.7%,而内源Oct4和c-Myc未见提高。4号细胞系在DOX存在的情况下,只有内源Sox2有所启动表达,占比为10.0%,在去除DOX之后,内源Sox2的表达最高达到100%,而内源Oct4、Klf4和c-Myc均未启动表达。通过小分子诱导分化所得到的神经前体细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR显示分化后的神经前体细胞表达多种神经细胞特异性基因,Q-PCR结果显示分化后多能因子的表达显着降低,神经特异性基因表达显着升高。免疫荧光染色结果和Western Blot显示细胞表达神经标志物βIII-Tubulin和Nf-l。利用小分子先将猪naive-like胚胎干细胞诱导至中间中胚层,再通过不同的小分子组合将中间中胚层细胞诱导为肾前体细胞,RT-PCR和Q-PCR鉴定结果表明分化细胞其中胚层谱系及肾细胞相关基因表达显着增高,Western Blot和免疫荧光结果显示分化后的肾前体细胞中表达肾脏标志物Wt-1。研究结论:验证了猪naive-like胚胎干细胞系的干细胞特性,不同的细胞系内外源转录因子的表达情况不尽相同,但所建细胞系都一定程度上依赖于外源转录因子的表达。在去除DOX诱导之后,内源Sox2的启动对于干细胞的生长及持续的自我更新至关重要。成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经前体细胞和肾前体细胞分化,为猪naive胚胎干细胞的建系及其诱导分化方法的建立提供参考。
陈丽[9](2019)在《“尾侧化”与“腹侧化”的分化模式对人胚胎干细胞定向诱导为中脑多巴胺能神经元的影响研究》文中认为研究目的:通过观察采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案调控人胚胎干细胞向中脑黑质多巴胺能神经元分化的可行性及效果,以便建立一种使人胚胎干细胞特异性向黑质多巴胺能神经元分化,而且效率高,培养成本相对较低,适合批量生产,可以满足临床移植和药物筛选、离体模型研究等需要的分化方案。方法:1、“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案诱导人胚胎干细胞分化1)第一阶段为人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能神经祖细胞。使用人胚胎干细胞H9和HN4,分别在基质胶和人重组层粘连蛋白-111包被的培养板上采用单层贴壁培养法,定向诱导分化16天。基础神经培养基为N2、B27培养基。加入因子为10μM Y-27632、10μM SB431542、100ng/m L头蛋白。为促进其“腹侧化”及“尾侧化”,培养基中再加入300ng/m L Shh-C24II和0.7μM CHIR99021。在分化第9天,加入100ng/m L成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)。在分化第11天,加入20 ng/m L脑源性神经营养因子(BDNF)、0.2m M L-抗坏血酸(AA)、100ng/m L FGF8b,促进中脑多巴胺能神经祖细胞的定型和区域化。2)第二阶段为中脑多巴胺能神经祖细胞的分化成熟,在分化第16天,加入20ng/m L BDNF、0.2m M AA、10ng/m L胶质细胞源性神经营养因子、500μM环化腺核苷一磷酸、1μMγ-分泌酶抑制剂,在上述培养条件下继续培养至42天,保证其分化为成熟的多巴胺能神经元。2、不同培养阶段细胞样本检测1)采用倒置相差显微镜检测细胞形态学变化;2)细胞免疫荧光检测中脑多巴胺能神经元相关标记物络氨酸羟化酶(TH)、微管相关蛋白2(MAP2)、叉头框转录因子A2(FOXA2)、LIM同源盒转录因子1(LMX1)、Orthodenticle同源框2(OTX2)、G蛋白激活内流钾通道蛋白2(GIRK2)、钙结合蛋白1(Calbindin1)等蛋白表达;3)实时荧光定量PCR(q PCR)检测TH、FOXA2、LMX1、A9(黑质致密部)多巴胺能神经元标记物GIRK2、A10(腹侧被盖区)多巴胺能神经元标记Calbindin1、Bar H同源框1(BARHL1)等相关基因表达;4)蛋白免疫印迹检测TH、FOXA2、LMX1、GIRK2等相关蛋白表达。结果:1、相同定向诱导条件下,在基质胶包被的培养板上的贴壁细胞数量、存活量、细胞产量较人重组层粘连蛋白-111上的数量多。2、本实验整个过程在基质胶包被的培养板上进行,细胞形态从典型干细胞形态-铺路石样逐渐分化为典型成簇多巴胺能神经元形态-梭形或多角形。3、细胞免疫荧光结果显示,在分化第16天,可见大量FOXA2+/LMX1+/OTX2+的腹侧中脑祖细胞,约占总细胞35%。在分化第42天,可见大量GIRK2+/TH+、FOXA2+/LMX1+、TH+/MAP2+、GIRK2+/LMX1+等细胞。4、qPCR结果显示:与胚胎干细胞相比,在分化第16天,细胞样本中可见FOXA2、LMX1、丘脑底核(STN)神经元标记物BARHL1、TH高表达(P<0.05);GIRK2、Calbindin1表达轻度升高(P<0.05)。与第16天相比,分化第42天细胞样本中可见FOXA2、LMX1、BARHL1表达较16天有所下降(P<0.05),但GIRK2、Calbindin1和TH明显升高(P<0.05)。5、蛋白免疫印迹检测结果显示:分化第42天,中脑多巴胺能神经元标记TH、FOXA2、LMX1均有表达,GIRK2表达明显升高。6、一定范围内调控CHIR99021浓度结果显示,随着CHIR99021浓度的不断增加,FOXA2阳性细胞数不断增加,而对LMX1+/OTX2+细胞数影响不大,在0.8μM时阳性细胞数最高。结论:1、基质胶作为包被剂可用于干细胞定向诱导分化,其促细胞粘附和细胞存活效果优于人重组层粘连蛋白-111的效果,并具有一定的经济价值。2、采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案,可以将人胚胎干细胞分化为大量A9多巴胺能神经元,并且在形态学改变、蛋白水平、基因水平上证实其中脑多巴胺能神经元特征,证实本方案是有效可行的。3、“尾侧化”诱导因子CHIR99021浓度与腹侧中脑祖细胞阳性率密切相关,一定范围内随CHIR99021浓度增加而增加。4、本研究方案所获得的神经元中主要为A9多巴胺能神经元,但仍包括少量的丘脑底核神经元和A10多巴胺能神经元,说明本方案仍然不十分完美,有进一步优化的可能性。
胥春龙[10](2018)在《CSK基因调控人多能性干细胞向定型内胚层分化的机制研究》文中进行了进一步梳理多能性干细胞(Pluripotent stem cells,PSC)与早期胚胎的内细胞团或上胚层细胞一样都具有分化成外、中、内胚层细胞的多向分化潜能,因此能够用来在体外模拟不同细胞谱系分化发育的过程以及大量制备具有疾病模拟、药物筛选和临床治疗等用途的细胞。过去,科学家通过利用爪蟾、斑马鱼、鸡和小鼠等模式动物初步阐明了脊椎动物胚胎发育过程中不同细胞谱系建立的信号通路与基因调控的基本原理,类似的发育学研究在人中受到取材与伦理的双重限制而难以开展,但是,随着多能性干细胞及其定向分化技术的不断发展,研究人员意识到人多能性干细胞体外定向分化模型是一个能帮助研究不同细胞谱系分化发育过程中信号通路、基因表达以及表观遗传学调控规律的有力工具。鉴于此,本研究利用多能性干细胞定向分化模型解析了非受体酪氨酸激酶基因CSK参与调控胚胎干细胞向定型内胚层(Definitive endoderm,DE)以及胰腺前体细胞分化过程的作用机制。首先,本研究通过激活Wnt和Nodal/Activin信号通路成功将人胚胎干细胞分化为SOX17与CXCR4双阳性的定型内胚层细胞,分析鉴定了 CSK及其下游靶基因SFK(SRC family kinase,SFK)在胚胎干细胞向内胚层以及胰腺分化过程中的表达变化情况,利用CRISPR/Cas基因编辑技术敲除CSK确认其为定型内胚层分化过程中的负调控基因,CSK敲除的胚胎干细胞分化形成SOX17与CXCR4双阳性细胞的效率接近95%,比野生型干细胞提高了 30%,而且通过小分子化合物PP1抑制CSK的靶基因SFK几乎完全阻断CSK野生型和敲除型胚胎干细胞向定型内胚层细胞的分化过程,SFK抑制后逆转CSK敲除后的分化表型的结果与过去关于CSK通过磷酸化抑制SFK的结论相一致,表明了 SFK信号通路的激活是定型内胚层分化所必需的。然后,本研究通过ATAC-seq分析胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中细胞基因组开放区域的动态变化规律,发现CSK野生型分化细胞存在大量受Hippo/YAP激活的开放基因组区域,而这些开放基因组区域在CSK敲除型分化细胞中很快被关闭,暗示CSK通过抑制Hippo/YAP通路促进定型内胚层细胞的分化,通过ROCK抑制剂Y27632阻碍YAP入核确实可以显着地提高CSK野生型胚胎干细胞的分化效率,与此相反,不论是CSK野生型还是敲除型胚胎干细胞,利用GPCR激动剂LPA促进YAP入核会极大地抑制它们形成定型内胚层的效率,证明CSK敲除导致的SFK激活对Hippo/YAP进行的有效抑制促进了胚胎干细胞向定型内胚层细胞谱系命运的转变。最后,为了进一步找到Hippo/YAP激活与抑制后下游关键的转录因子调控机制,本研究分别对多能性干细胞和定型内胚层细胞特异性表达的关键转录因子进行分析,发现YAP抑制后分化细胞中内胚层细胞特异性的转录因子EOMES、GATA6和SOX17迅速被激活,同时多能性因子OCT4的表达迅速被抑制,但是YAP激活后内胚层细胞特异性的转录因子EOMES、GATA6和SOX17的表达受到显着抑制,而多能性基因OCT4持续高表达,说明有效关闭多能性基因的表达对于完全激活定型内胚层细胞特异性转录因子调控网络具有重要的作用。鉴于ROCK抑制剂对Hippo/YAP通路的阻碍作用,本研究优化分化培养条件后显着提高了定型内胚层和胰腺前体细胞的分化效率,这将为完善人多能性干细胞体外分化技术提供新的思路。综上所述,本研究通过成功构建多能性干细胞体外定向分化模型揭示了 CSK基因在胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化过程中独特的信号通路、转录因子和染色质重塑的调控规律。
二、人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展(论文提纲范文)
(1)KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第1章 引言 |
1.1 原始生殖细胞在体内的发育及特化机制 |
1.1.1 mPGC体内发育、特化及表观重编程 |
1.1.2 hPGC体内发育及特化机制 |
1.2 体外诱导ESC成原始生殖细胞样细胞 |
1.2.1 体外诱导mESC成有功能的配子 |
1.2.2 体外诱导hESC成原始生殖细胞样细胞 |
1.2.3 利用PGCLC研究生殖细胞分化调控机制 |
1.3 表观遗传调控对PGC发育的影响 |
1.3.1 表观遗传学的定义 |
1.3.2 表观基因组的重编程 |
1.3.3 DNA甲基化对生殖细胞发育的影响 |
1.3.4 组蛋白甲基化修饰对早期PGC发育的影响 |
1.3.5 组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDMs)对精子发生的影响 |
1.4 KDM2B的研究进展 |
1.4.1 KDM2B在体细胞重编程中的作用 |
1.4.2 KDM2B在体细胞分化中的作用 |
1.4.3 KDM2B对生殖细胞发育的影响 |
1.5 本研究的意义 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株及细胞 |
2.1.2 实验用质粒和重组慢病毒载体 |
2.2 实验仪器、试剂和耗材 |
2.2.1 分子克隆实验试剂的配制 |
2.2.2 细胞实验相关试剂以及培养基的配制 |
2.2.3 免疫荧光相关试剂及配制 |
2.2.4 Western Blotting等生化实验相关试剂及配制 |
2.2.5 主要抗体列表 |
2.2.6 主要引物列表 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 人类胚胎干细胞的培养及原始生殖细胞样细胞的诱导分化 |
2.3.2 大肠杆菌DH5-α感受态细胞的制备 |
2.3.3 利用CRISPR/Cas9技术建立KDM2B敲除的hES细胞系 |
2.3.4 Dox诱导KDM2B表达细胞系的建立 |
2.3.5 质粒大提 |
2.3.6 核型分析 |
2.3.7 总RNA的提取 |
2.3.8 mRNA逆转录合成cDNA |
2.3.9 定量PCR检测 |
2.3.10 Western blotting |
2.3.11 细胞增殖检测 |
2.3.12 冰冻切片 |
2.3.13 免疫荧光染色 |
2.3.14 小鼠畸胎瘤的诱导及石蜡包埋切片 |
2.3.15 苏木精和伊红染色 |
2.3.16 流式细胞分选 |
2.3.17 RNA-seq及数据分析 |
2.3.18 统计学处理 |
第3章 第一部分结果:KDM2B参与调控生殖细胞特化 |
3.1 KDM2B在人类胎儿生殖细胞及hPGCLC中高表达 |
3.2 pX330-EGFP-KDM2B重组质粒的构建及鉴定 |
3.3 构建KDM2B敲除的人类胚胎干细胞系 |
3.4 KDM2B缺失的hESC中H3K4me3全局水平增高 |
3.5 缺失KDM2B不影响hESC的自我更新能力 |
3.6 缺失KDM2B对hESC向三胚层分化没有明显影响 |
3.7 KDM2B的耗竭损害了hPGCLC的分化 |
3.8 讨论 |
第4章 第二部分结果:KDM2B通过调控早期转录组的转变,促进hPGCLC分化 |
4.1 缺失KDM2B的hES细胞功能发生了紊乱 |
4.2 KDM2B KO Day 1hPGCLC中体细胞基因的表达异常上调 |
4.3 缺失KDM2B引起表观遗传因子改变 |
4.4 KDM2B KO Day 2hPGCLCs中多能性基因的表达异常 |
4.5 KDM5B在男性胎儿生殖细胞及hPGCLC中高表达 |
4.6 PX330-EGFP-KDM5B重组质粒的构建及鉴定 |
4.7 构建KDM5B敲除的人类胚胎干细胞系 |
4.8 缺失KDM5B对hESC关键多能基因的表达没有明显影响 |
4.9 KDM5B在hPGCLC的分化中无关紧要 |
4.10 讨论 |
第5章 第三部分结果:表达外源性KDM2B能有效挽救hPGCLC的分化受损 |
5.1 TetO-FUW-KDM2B重组质粒的构建及鉴定 |
5.2 慢病毒包装TetO-FUW-KDM2B重组质粒及鉴定病毒效果 |
5.3 TetO-FUW-KDM2B病毒感染hESC构建稳定细胞株 |
5.4 Dox诱导外源性KDM2B的表达呈WT内源性水平 |
5.5 诱导表达外源性KDM2B恢复了hPGCLC的分化效率 |
5.6 讨论 |
第6章 总结与展望 |
6.1 总结 |
6.2 展望 |
参考文献 |
缩略词表 |
攻读学位期间成果 |
致谢 |
(2)猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
常用中英文缩略词表 |
1 前言 |
1.1 研究问题的由来 |
1.2 猪早期胚胎发育的相关研究 |
1.3 多能性干细胞的分类 |
1.3.1 干细胞的多能性等级分类 |
1.3.2 干细胞来源分类 |
1.4 胚胎干细胞的生物学特征 |
1.4.1 形态学特征 |
1.4.2 多能性特征 |
1.4.3 遗传可操作性 |
1.5 猪胚胎干细胞建系影响因素进展研究 |
1.5.1 胚胎种类 |
1.5.2 胚胎接种方法 |
1.5.3 饲养层细胞 |
1.5.4 培养体系 |
1.5.5 传代方法 |
1.6 胚胎干细胞多能性通路研究 |
1.6.1 JAK-STAT信号通路 |
1.6.2 PI3K-AKT信号通路 |
1.6.3 WNT信号通路 |
1.6.4 MAPK信号通路 |
1.6.5 TGF-β信号通路 |
1.6.6 Na?ve和 Primed细胞多能性调控差异 |
1.7 .胚胎干细胞鉴定方法 |
1.7.1 形态学鉴定 |
1.7.2 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色 |
1.7.3 核型分析 |
1.7.4 实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,q RT-PCR) |
1.7.5 免疫荧光(Immunofluorescence staining,IF)染色 |
1.7.6 免疫印迹(Western blotting,WB) |
1.7.7 体外分化能力 |
1.7.8 畸胎瘤形成 |
1.7.9 嵌合体实验 |
1.8 胚胎干细胞应用前景及存在的问题 |
1.8.1 胚胎干细胞的应用前景 |
1.8.2 胚胎干细胞存在的问题 |
1.9 本研究的目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 试验材料和动物 |
2.1.2 主要仪器和设备 |
2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
2.1.4 主要试剂的配制 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 猪卵母细胞体外成熟培养 |
2.2.2 猪孤雌胚胎获取 |
2.2.3 猪体外受精胚胎获取 |
2.2.4 猪体内胚胎获取 |
2.2.5 饲养层细胞制备 |
2.2.5.1 小鼠胎儿成纤维细胞原代分离 |
2.2.5.2 小鼠胎儿成纤维细胞传代培养及冻存 |
2.2.6 猪胚胎干细胞系构建及培养 |
2.2.6.1 猪胚胎干细胞系的构建 |
2.2.6.2 猪胚胎干细胞的传代培养 |
2.2.6.3 猪胚胎干细胞的冻存与复苏 |
2.2.7 多能性鉴定 |
2.2.7.1 碱性磷酸酶染色 |
2.2.7.2 核型分析 |
2.2.7.3 免疫荧光染色 |
2.2.7.4 蛋白免疫印迹 |
2.2.7.5 RNA提取 |
2.2.7.6 反转录 |
2.6.7.7 实时荧光定量PCR |
2.2.8 拟胚体形成 |
2.2.9 脂质体转染 |
2.2.10 数据分析 |
2.3 试验设计 |
3 结果 |
3.1 不同发育时期的猪体内胚胎的转录组分析 |
3.2 hLIF、rpIL6、CHIR99021、bFGF、BMP4、PD0325901 以及SB431542 等对猪孤雌胚胎囊胚发育的影响 |
3.3 不同浓度的CHIR99021及WNT通路的抑制剂IWR1 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
3.4 不同浓度的rpIL6及JAK-STAT通路的抑制剂AZD1480 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
3.5 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
3.6 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪IVF胚胎发育的影响 |
3.7 LCDM体系干细胞系构建及多能性鉴定 |
3.7.1 LCDM相关体系转化 |
3.7.2 LCDM相关体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
3.8 pEPSC体系胚胎干细胞建系多能性鉴定 |
3.8.1 pEPSC体系优化 |
3.8.2 pEPSC体系的猪孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
3.8.3 pEPSC体系的猪体内胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
3.9 KOFL体系中添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可获得多能性提高的干细胞系 |
3.10 LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
3.10.1 LSCFors体系转化 |
3.10.2 LSCFors体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
3.11 F-LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
3.11.1 F-LSCFors体系细胞转化 |
3.11.2 F-LSCFors体系的孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
3.12 LSCFors和 F-LSCFors体系细胞基因表达差异分析 |
4 讨论 |
4.1 猪早期胚胎体外培养液的优化 |
4.2 猪胚胎干细胞体外培养液的优化 |
5 小结 |
5.1 本研究的主要结论 |
5.2 本研究的创新之处 |
5.3 本研究的不足 |
5.4 本研究的下一步工作计划 |
参考文献 |
附录 |
攻读博士期间发表的论文 |
致谢 |
(3)OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
主要符号对照表 |
文献综述 |
第一章 多能干细胞研究进展 |
1.1 多能干细胞的建立及分类 |
1.1.1 多能干细胞的概述 |
1.1.2 胚胎干细胞研究进展 |
1.1.3 细胞重编程的研究进展 |
1.1.3.1 诱导性多能干细胞的建立 |
1.1.3.2 猪诱导性多能干细胞的研究进展 |
1.2 多能干细胞的维持机制研究 |
1.2.1 多能性核心转录因子的研究进展 |
1.2.1.1核心转录因子Oct4 |
1.2.1.2核心转录因子Sox2 |
1.2.2 多能性调控通路 |
1.2.2.1 细胞因子维持多能性 |
1.2.2.2 小分子抑制剂维持多能性 |
1.2.2.2.1 Wnt信号通路与多能性维持 |
1.2.2.2.2 MAPK/Erk信号通路与多能性维持 |
1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信号通路抑制剂SB431542 |
1.2.2.3 MEF饲养层细胞 |
第二章 H3K9甲基化修饰的研究进展 |
2.1 细胞重编程过程中的表观遗传调控 |
2.1.1 表观遗传学 |
2.1.2 DNA甲基化修饰 |
2.1.2 组蛋白共价修饰 |
2.1.3.1 组蛋白乙酰化修饰 |
2.1.3.2 组蛋白甲基化修饰 |
2.2 H3K9甲基化及功能 |
2.3 多能态建立过程中H3K9甲基化的作用 |
2.3 组蛋白去甲基化酶的研究进展 |
2.4 组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的研究进展 |
2.5 多能态建立过程中组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的作用 |
2.6 小结与展望 |
试验研究 |
第三章 猪iPSCs多能态转换过程中H3K9 甲基化的变化规律 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 试验材料 |
3.1.2 试验方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 撤去DOX及多能培养体系对猪DOX-i PSCs的影响 |
3.2.2 piPSCs多能性丧失过程中H3K9与H3K4 甲基化修饰水平的变化 |
3.2.3 筛选影响H3K9甲基化的主要因素 |
3.2.4 F-与FD-处理下pi PSCs表型检测 |
3.2.5 F-与FD-处理下pi PSCs多能基因检测 |
3.2.6 F-与FD-处理下pi PSCs组蛋白甲基化修饰水平的变化 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 Feeder与外源基因协同维持猪i PSCs多能性机制解析 |
4.1 材料和方法 |
4.1.1 试验材料 |
4.1.2 试验方法 |
4.2 结果 |
4.2.1 转录组测序揭示F-与FD-组的基因表达变化 |
4.2.2 功能富集分析揭示整个分化过程中转录变化 |
4.2.3 H3K9me2/me3 在基因组上的分布情况 |
4.2.4 Ch IP-seq分析分化过程中H3K9me2和H3K9me3 的变化情况 |
4.2.5 多能性丧失过程中H3K9 甲基化motif变化分析。 |
4.2.6 H3K9甲基化与转录组联合分析揭示其作用机理 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 KDM3A与 KDMB协同调节H3K9 甲基化修饰维持猪多能性调控网络 |
5.1 材料和方法 |
5.1.1 试验材料与耗材 |
5.1.2 试验方法 |
5.2 结果 |
5.2.1 KDM3A与 KDM3B共干扰导致猪i PSCs丧失多能性 |
5.2.2 猪i PSCs中共干扰KDM3A与 KDM3B后的转录组变化 |
5.2.2 干扰KDM3A与 KDM3B抑制PI3K-AKT信号通路影响多能性 |
5.2.4 KDM3A与 KDM3B过表达对猪i PSCs多能性的影响 |
5.2.5 转录组测序揭示KDM3A与 KDM3B过表达的分子作用机制 |
5.2.6 KDM3A过表达可抑制F-处理下引发的细胞分化 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
第六章 转录因子OCT4与SOX2 是维持猪i PSCs多能性调控网络的核心 |
6.1 材料和方法 |
6.1.1 试验材料与耗材 |
6.1.2 试验方法 |
6.2 结果 |
6.2.1 不同DOX浓度下猪i PSCs的表型变化 |
6.2.2 筛选维持猪iPSCs多能性的关键转录因子 |
6.2.3 无DOX下过表达OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性 |
6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性机理 |
6.2.5 转录因子之间调控网络建立 |
6.3 讨论 |
6.4 小结 |
第七章 OCT4/SOX2 与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B互作维持猪i PSCs多能性 |
7.1 材料和方法 |
7.1.1 试验材料与耗材 |
7.1.2 试验方法 |
7.2 结果 |
7.2.1 OCT4与SOX2 并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达 |
7.2.2 H3K9去甲基化作用与核心转录因子之间的协同关系 |
7.2.3 转录调控水平揭示KDM3A与 OCT4/SOX2 之间的协作关系 |
7.2.4 IP-MS揭示KDM3A与 KDM3B的蛋白互作网络 |
7.3 讨论 |
7.4 小结 |
结论 |
论文创新点及下一步研究方向 |
创新点 |
下一步研究方向 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(4)猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究(论文提纲范文)
摘要 |
英文摘要 |
1 前言 |
1.1 血管内皮细胞与心血管疾病 |
1.1.1 血管内皮细胞的发生 |
1.1.2 血管内皮细胞的病变与心血管疾病 |
1.1.3 心血管疾病的治疗现状 |
1.2 多能性干细胞 |
1.2.1 多能性干细胞的分类和特征 |
1.2.2 多能性干细胞应用的前景和挑战 |
1.3 多能性干细胞向血管内皮细胞的定向分化 |
1.3.1 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究进展 |
1.3.2 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的鉴定 |
1.4 研究目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物及材料 |
2.1.2 主要仪器及设备 |
2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
2.1.4 常用试剂及配制方法 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 细胞培养 |
2.2.2 病毒包装 |
2.2.3 猪诱导多能性干细胞的建系 |
2.2.4 细胞多能性鉴定 |
2.2.5 Realtime-PCR检测 |
2.2.6 猪多能性干细胞向血管内皮细胞的诱导分化 |
2.2.7 流式细胞分选 |
2.2.8 血管内皮细胞的功能鉴定 |
2.2.9 数据统计与分析 |
3 结果与分析 |
3.1 猪多能性干细胞的获得及鉴定 |
3.1.1 猪诱导多能性干细胞的获得及鉴定 |
3.1.2 猪多能性干细胞的培养及鉴定 |
3.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层分化潜能的比较 |
3.2.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中的形态比较 |
3.2.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中谱系标记基因的表达比较 |
3.3 piPSCs向中胚层分化的诱导体系的筛选 |
3.4 piPSCs向血管内皮细胞诱导分化体系的建立 |
3.4.1 不同处理对piPSCs向中胚层分化过程中谱系标记基因表达的影响 |
3.4.2 不同处理对piPSCs向血管内皮细胞分化效率的影响 |
3.4.3 piPSCs来源的血管内皮细胞(pi PSC-ECs)的鉴定 |
3.5 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化进程的比较 |
3.5.1 piPSCs和 h ESCs向中胚层分化过程中谱系标记基因的表达比较 |
3.5.2 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化效率的比较 |
3.5.3 pi PS-ECs和 h ES-ECs的形态、基因表达和体外功能的比较 |
4 讨论 |
4.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层的分化潜能 |
4.2 猪多能性干细胞向中胚层分化的调控 |
4.3 猪诱导多能性干细胞来源的血管内皮细胞的鉴定 |
4.4 多能性干细胞向血管内皮细胞诱导分化体系的物种特异性 |
5 结论 |
致谢 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 |
(5)TGF-β信号通路对猪类胚胎干细胞PeNK6多能性的影响(论文提纲范文)
摘要 |
英文摘要 |
1 前言 |
1.1 干细胞研究进展 |
1.1.1 干细胞的特征 |
1.1.2 干细胞的分类 |
1.1.3 多能性干细胞研究进展 |
1.2 猪胚胎干细胞研究概述 |
1.2.1 猪胚胎干细胞研究进展 |
1.2.2 猪胚胎干细胞研究面临的问题 |
1.3 TGF-β信号通路 |
1.3.1 TGF-β信号通路概述 |
1.3.2 TGF-β信号通路对胚胎干细胞多能性的影响 |
1.4 猪类胚胎干细胞PeNK6研究现状 |
1.5 本研究的目的意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要仪器设备 |
2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
2.1.4 主要引物列表 |
2.1.5 常用试剂及配置 |
2.1.6 生物信息学分析软件 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 猪类胚胎干细胞的培养 |
2.2.2 猪类胚胎干细胞的多能性鉴定 |
2.2.3 转录组测序数据的获得与分析 |
2.2.4 统计分析 |
3 结果与分析 |
3.1 PeNK6细胞系的生物学特征 |
3.1.1 PeNK6细胞系的多能性特征 |
3.1.2 PeNK6细胞系中TGF-β信号通路呈激活状态 |
3.2 抑制TGF-β信号通路对PeNK6细胞系多能性的影响 |
3.2.1 TGF-β抑制剂A83-01 应用于PeNK6细胞系最佳浓度筛选 |
3.2.2 不同方案抑制TGF-β信号通路对PeNK6细胞系多能性特征的影响 |
3.3 在抑制TGF-β信号培养体系下建立猪类胚胎干细胞系及其生物学特征检测 |
3.4 Pe NK6+SB/+A/Pe WKSB细胞系中TGF-β信号通路状态分析 |
4 讨论 |
5 结论 |
致谢 |
参考文献 |
攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
(6)猪胚胎干细胞与多能性信号通路关系的研究(论文提纲范文)
摘要 |
英文摘要 |
1 前言 |
1.1 猪胚胎干细胞的研究进展 |
1.1.1 猪胚胎干细胞的衍生 |
1.1.2 猪胚胎干细胞培养环境的发展 |
1.1.3 猪胚胎干细胞的建系所需胚胎发育阶段的选择 |
1.2 多能性干细胞依赖的信号通路 |
1.2.1 LIF/STAT3 信号通路 |
1.2.2 FGF/MEK/ERK信号通路 |
1.2.3 TGF-β/SMAD信号通路 |
1.2.4 经典Wnt/β-catenin信号通路 |
1.2.5 Na?ve人胚胎干细胞的获得 |
1.3 猪胚胎干细胞与多能性信号通路的关系 |
1.4 研究目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物和材料 |
2.1.2 仪器与设备 |
2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
2.1.4 常用试剂及配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 细胞培养 |
2.2.2 胚胎收集和细胞培养 |
2.2.3 多能性鉴定 |
2.2.4 其它主要实验方法 |
3 结果与分析 |
3.1 比较分析猪类胚胎干细胞的生长特性及多能性 |
3.1.1 三种猪类胚胎干细胞的生长特性的比较分析 |
3.1.2 三种猪类胚胎干细胞的多能性检测 |
3.2 LIF/JAK/STAT3 信号通路对猪胚胎来源干细胞多能性的影响 |
3.2.1 猪类胚胎干细胞信号通路Realtime检测及RNA-seq数据分析 |
3.2.2 高浓度LIF对猪胚胎干细胞的影响 |
3.2.3 IL-6对猪胚胎干细胞的影响 |
3.2.4 KO样细胞系不依赖LIF/STAT3 信号通路 |
3.3 FGF/MEK/ERK信号通路对猪胚胎来源干细胞多能性的影响 |
3.3.1 猪类胚胎干细胞信号通路Realtime数据及RNA-seq数据分析 |
3.3.2 猪类胚胎干细胞建系依赖FGF/MEK/ERK信号通路 |
3.3.3 b FGF的持续添加有利于primed多能性状态的干细胞的维持 |
3.4 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对猪胚胎来源干细胞多能性的影响 |
3.4.1 猪类胚胎干细胞信号通路Realtime数据及RNA-seq数据分析 |
3.4.2 抑制TGF-β/Activin/Nodal信号通路可以改善KO细胞系的多能性状态 |
3.4.3 利用TGF-β/Activin/Nodal抑制剂进行建系 |
3.5 WNT信号通路对猪胚胎来源干细胞多能性的影响 |
3.5.1 猪类胚胎干细胞信号通路realtime数据及RNA-seq数据分析 |
3.5.2 WNT信号通路的激活或抑制均不能改善猪胚胎干细胞的多能性状态 |
3.5.3 XAV939和CHIR99021 小分子可以将KO细胞系转变为na?ve形态克隆 |
3.5.4 两个小分子的添加可以提高猪类胚胎干细胞的细胞活力 |
3.5.5 KOCHX细胞系的WNT信号通路状态 |
3.5.6 利用CHIR99021和XAV9393 从囊胚中获得的新的细胞系 |
4 讨论 |
4.1 LIF/STAT3 信号通路在猪胚胎干细胞中的特点 |
4.2 猪多能性干细胞对FGF/ERK信号通路的依赖 |
4.3 抑制TGF-β/Activin/Nodal促进na?ve状态干细胞的衍生 |
4.4 WNT信号通路在猪胚胎干细胞中的特点 |
4.5 维持猪胚胎干细胞的多能性细胞信号通路 |
5 结论 |
致谢 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 |
(7)人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
引言 |
第一部分 角膜内皮移植手术方式的改良 |
第一章 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 实验动物 |
1.1.2 实验器械 |
1.1.3 实验仪器 |
1.1.4 实验耗材 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 兔原代角膜内皮细胞的培养 |
1.2.2 细胞存活率测定实验 |
1.2.3 免疫荧光染色 |
1.2.4 细胞悬液制备 |
1.2.5 角膜内皮植片的构建 |
1.2.6 前房注射法行角膜内皮细胞移植及术后评估 |
1.2.7 角膜后弹力层剥除内皮移植术行角膜内皮细胞移植 |
1.2.8 活体共焦角膜显微镜检查 |
1.2.9 角膜厚度测量 |
1.2.10 眼压测量 |
1.3 统计学分析 |
第二章 结果 |
2.1 单细胞前房注射法与DSEK法行细胞移植的对比研究 |
2.2 迷你植片制备方法的建立 |
2.2.1 制备迷你植片的消化酶的确定 |
2.2.2 制备迷你植片消化时间的确定 |
2.3 迷你植片移植细胞的贴壁能力测定 |
2.3.1 迷你植片体外促进移植细胞贴壁 |
2.3.2 迷你植片体内促进移植细胞贴附 |
2.4 迷你植片移植后体内细胞功能测定 |
2.4.1 迷你植片促进移植细胞形成屏障功能 |
2.4.2 迷你植片促进移植细胞的泵功能形成 |
第三章 讨论 |
第二部分 人胚胎干细胞向角膜内皮样细胞的诱导分化 |
第一章 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 实验动物 |
1.1.2 实验器械 |
1.1.3 实验仪器 |
1.1.4 实验耗材 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 人胚胎干细胞的培养及诱导分化 |
1.2.2 免疫荧光染色 |
1.2.3 实时荧光定量PCR |
1.2.4 流式细胞仪检测 |
1.2.5 成瘤性检测 |
1.2.6 石蜡切片的制作及苏木素-伊红染色 |
1.3 统计学分析 |
第二章 结果 |
2.1 人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞 |
2.2 人胚胎干细胞诱导分化为神经嵴细胞的相关检测 |
2.3 神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮样细胞 |
2.4 诱导hESC向角膜内皮样细胞定向分化的基因表达时程变化 |
2.5 诱导的角膜内皮样细胞的安全性 |
第三章 讨论 |
第三部分 胚胎干细胞诱导的角膜内皮细胞对于角膜内皮失代偿动物的治疗效果 |
第一章 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 实验动物 |
1.1.2 实验器械 |
1.1.3 实验仪器 |
1.1.4 实验耗材 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 前房注射法行新西兰大白兔角膜内皮移植及术后评估 |
1.2.2 前房注射法行食蟹猴角膜内皮移植术及术后评估观察 |
1.2.3 免疫荧光染色 |
1.2.4 茜素红染色 |
1.2.5 地高辛标记细胞 |
1.2.6 活体共焦角膜显微镜检查 |
1.2.7 角膜厚度测量 |
1.2.8 眼压测量 |
1.3 统计学分析 |
第二章 结果 |
2.1 hESC诱导的角膜内皮样细胞治疗兔角膜内皮失代偿的疗效评估 |
2.1.1 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜透明度的变化 |
2.1.2 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜厚度的变化 |
2.1.3 诱导的角膜内皮样细胞移植后的形态学变化 |
2.1.4 诱导的角膜内皮样细胞移植后的追踪 |
2.2 hESC诱导的角膜内皮样细胞治疗猴角膜内皮失代偿的疗效评估 |
2.2.1 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜的变化 |
2.2.2 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜厚度的变化 |
2.2.3 诱导的角膜内皮细胞移植后的形态学变化 |
2.2.4 诱导的角膜内皮样细胞移植后的追踪 |
第三章 讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
综述参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
主要缩略词表 |
致谢 |
(8)猪naive-like胚胎干细胞的鉴定及体外定向诱导分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一部分 猪naive-like胚胎干细胞系的鉴定及内、外源转录因子表达的研究 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
分析与讨论 |
第二部分 猪naive-like胚胎干细胞向外胚层神经前体细胞和中胚层肾前体细胞体外诱导分化 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
分析与讨论 |
参考文献 |
综述 猪胚胎干细胞建系研究进展及相应对策 |
参考文献 |
攻读学位期间发表文章情况 |
全文主要缩略语 |
致谢 |
(9)“尾侧化”与“腹侧化”的分化模式对人胚胎干细胞定向诱导为中脑多巴胺能神经元的影响研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
1 材料与方法 |
1.1 选用细胞 |
1.2 主要实验试剂 |
1.3 主要实验耗材及仪器设备 |
1.4 主要溶液配置 |
1.5 实验方法 |
2 实验结果 |
2.1 人胚胎干细胞的定向诱导方案 |
2.2 免疫荧光染色观察不同阶段的定向诱导细胞相关蛋白表达变化 |
2.3 qPCR 检测不同阶段的定向诱导细胞相关 mRNA 表达的影响 |
2.4 Western blot检测定向诱导的终末神经元的蛋白表达情况 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 人多能干细胞向多巴胺能神经元分化:异质性的安全风险 |
综述参考文献 |
个人简历 |
致谢 |
(10)CSK基因调控人多能性干细胞向定型内胚层分化的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词表 |
第一章 前言 |
引言 |
1.1 脊椎动物定型内胚层发育模式概述 |
1.1.1 爪蟾、斑马鱼和小鼠的定型内胚层发育模式 |
1.1.2 定型内胚层来源的组织器官在体形成过程 |
1.1.3 人多能性干细胞体外定向分化技术 |
1.1.4 利用人多能性干细胞定向分化技术构建分化发育的体外模型 |
1.2 调控人多能性干细胞多能性维持和分化的信号通路 |
1.2.1 调控人多能性干细胞多能性维持的信号通路 |
1.2.2 调控人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的信号通路研究 |
1.2.3 细胞周期在人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化过程中的作用 |
1.2.4 Hippo/YAP信号通路及其与定型内胚层分化的关系 |
1.2.5 人多能性干细胞定向分化过程中表观遗传因子的调控规律 |
1.3 CSK基因及相关信号通路的研究概述 |
1.3.1 CSK激酶及其底物蛋白SFK的结构和功能 |
1.3.2 CSK/SFK信号通路的调控机制 |
1.3.3 CSK与SFK基因在胚胎发育与细胞分化中的功能研究进展 |
1.4 CRISPR/Cas基因组编辑技术 |
1.4.1 CRISPR/Cas基因组编辑技术的应用概述 |
1.5 本研究的目的与意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株、质粒和病毒 |
2.1.2 实验仪器和耗材 |
2.1.3 细胞系 |
2.1.4 常用试剂及抗体 |
2.1.5 常用分子生物学试剂配制 |
2.1.6 常用细胞生物学试剂配制 |
2.1.7 数据分析软件和网站 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 慢病毒的包装流程 |
2.2.2 人胚胎干细胞的培养与转染 |
2.2.3 CRISPR/Cas技术介导的多能性干细胞基因组编辑 |
2.2.4 RNA的提取与定量技术 |
2.2.5 蛋白的提取与印迹杂交流程 |
2.2.6 免疫荧光染色技术 |
2.2.7 流式细胞染色和分析流程 |
2.2.8 人胚胎干细胞向内胚层细胞分化流程 |
2.2.9 内胚层细胞向胰腺祖细胞分化流程 |
2.2.10 人胚胎干细胞向神经外胚层细胞分化流程 |
2.3 二代测序数据的分析方法 |
2.3.1 RNA-seq分析流程 |
2.3.2 ATAC-seq分析流程 |
第三章 实验结果与分析 |
3.1 ESC向DE定向分化中的转录组与标记基因表达分析 |
3.1.1 ESC向DE定向分化过程中5000个变化最显着基因的表达谱 |
3.1.2 ESC与DE核心的特异性基因表达谱变化 |
3.1.3 ESC向DE定向分化中标记基因的流式分析 |
3.1.4 ESC向DE定向分化中标记基因免疫荧光染色分析 |
3.1.5 ESC与DE转录组差异表达分析和GO富集分析 |
3.1.6 ESC、DE、PF、PP和β样细胞转录组主成分分析 |
3.2 CSK基因鉴定为DE定向分化的负调控基因 |
3.2.1 CRISPR筛选得到CSK为DE定向分化的负调控基因 |
3.2.2 CRISRP介导的CSK基因敲除实验 |
3.2.3 CSK在ESC不同分化阶段的表达水平变化 |
3.2.4 CSK的经典靶基因SFK在ESC不同分化阶段表达水平变化 |
3.2.5 CSK敲除不影响ESC的多能性 |
3.2.6 CSK敲除不影响ESC向其他胚层的分化潜能 |
3.2.7 结果讨论与分析 |
3.3 CSK敲除对ESC向DE分化能力影响的信号通路与表观机制研究 |
3.3.1 SFK小分子抑制剂阻滞CSK敲除和野生型ESC向DE分化 |
3.3.2 CSK对定型内胚层细胞分化相关信号通路中的关键基因具有调控作用 |
3.3.3 ATAC-seq揭示野生型ESC向DE分化时的表观基因组变化 |
3.3.4 Hippo/YAP信号通路在CSK野生型与敲除细胞中存在差异性的调控模式 |
3.3.5 YAP在分化细胞的细胞核和细胞质中存在差异分布 |
3.3.6 Hippo/YAP信号通路抑制剂可以提高定型内胚层分化效率 |
3.3.7 ATAC-seq揭示CSK野生型与敲除细胞中存在差异化基因组区域开放模式 |
3.3.8 结果讨论与分析 |
3.4 CSK敲除后YAP对DE特异性转录因子EOMES和GATA6的影响研究 |
3.4.1 CSK敲除解除YAP对EOMES和GATA6的抑制而促进DE的定向分化 |
3.4.2 LPA激活Hippo/YAP信号通路阻碍GATA6激活来抑制DE的定向分化 |
3.4.3 抑制Hippo/YAP可以提高胰腺前体细胞的分化效率 |
3.4.4 结果讨论与分析 |
第四章 讨论与展望 |
4.1 CSK/SFK负调控Hippo/YAP信号通路促进ESC向DE分化的分子机制 |
4.2 ROCK抑制剂解除Hippo/YAP对定型内胚层和胰腺前体细胞分化的阻碍作用 |
第五章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
个人简历 |
四、人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展(论文参考文献)
- [1]KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制[D]. 袁伟燕. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究[D]. 尹姝媛. 华中农业大学, 2020(04)
- [3]OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制[D]. 祝振硕. 西北农林科技大学, 2020
- [4]猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究[D]. 伟人悦. 东北农业大学, 2020(04)
- [5]TGF-β信号通路对猪类胚胎干细胞PeNK6多能性的影响[D]. 吴爽. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]猪胚胎干细胞与多能性信号通路关系的研究[D]. 李妍. 东北农业大学, 2020(04)
- [7]人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究[D]. 贾艳妮. 青岛大学, 2019(07)
- [8]猪naive-like胚胎干细胞的鉴定及体外定向诱导分化的研究[D]. 王晨宇. 南京医科大学, 2019(08)
- [9]“尾侧化”与“腹侧化”的分化模式对人胚胎干细胞定向诱导为中脑多巴胺能神经元的影响研究[D]. 陈丽. 海南医学院, 2019(01)
- [10]CSK基因调控人多能性干细胞向定型内胚层分化的机制研究[D]. 胥春龙. 中国农业大学, 2018(02)