一、豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨（论文文献综述）
钟诚[1]（2016）在《EPO对大鼠螺旋神经元损伤保护及其分子机理初步研究》文中认为目的感音神经性聋是耳科学领域难点及热点问题。内耳螺旋神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的凋亡是导致感音神经性聋的主要因素之一,促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）被认为在脑、脊髓等中枢神经系统广泛表达并具有神经保护作用,但在大鼠内耳是否表达,以及对内耳SGNs是否具有神经保护作用则不清楚。探讨EPO在大鼠内耳螺旋神经元兴奋毒性损伤中的作用及相关机制,为SGNs的兴奋毒性损伤保护提供新的理论。材料与方法1、通过免疫组织化学、荧光激光共聚焦扫描荧光显微镜技术明确EPO在内耳中有无表达情况。2、分离大鼠耳蜗及体外培养SGNs并鉴定。3、采用不同浓度谷氨酸（0,10,25,50,75,100μmol/L）分别作用于培养48小时的螺旋神经元,MTT、TUNEL法分别检测SGNs的细胞活力、细胞凋亡。4.构建重组腺病毒载体Ad-EPO并转染到体外培养的SGNs,选择0,20,50,100,150,250PFU的不同感染复数（MOI）及24h,48h和72h的不同感染时长,通过报告基因绿色荧光蛋白（GFP）表达检测感染率,确定最佳感染倍数和病毒表达时间。5.分别经RT-PCR、Western Blot检测Ad-EPO感染SGNs后细胞中EPO的mRNA和蛋白表达水平。体外培养细胞经谷氨酸处理后,分别用MTT、TUNEL法和Caspase-3法检测转染腺病毒Ad-EPO的SGNs的细胞活力、细胞凋亡情况。6.构建靶向EPO基因重组shRNA表达载体pGenesil-EPO并将EPO siRNA转染到SGNs。检测干扰载体感染细胞后EPO的mRNA及蛋白表达水平;检测在谷氨酸兴奋毒性损伤环境下,经干扰载体感染后的螺旋神经元的细胞活性和凋亡情况。7、采用荧光定量PCR和Westernblot方法分别测定PI3K/Akt信号通路中的pAKT、FOXO3a、GSK-3β相对表达水平变化,分析PI3K/Akt信号通路是否参与在EPO对Glu所致兴奋毒性损伤的SGNs神经保护中的调控机制。结果1、EPO及EPO-R在大鼠内耳中SGNs、血管纹、Corti器中均有表达,主要位于细胞膜、胞浆与胞质。2、SGNs在24-48小时后多数呈典型双极神经元,胞体椭圆形或圆形,突起细长,其长度常为胞体数倍。NSE行免疫荧光化学鉴定,可在荧光显微镜下见到神经元的胞体及突起呈红色荧光,胞核明显,少数仅胞体显示有荧光。3、MTT检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,与对照组相比,50、75、100μmol/L组的活性与对照组比较明显下降,差异有显着意义（P<0.01）。凋亡率与对照组比较明显上升,差异有显着意义（P<0.01）。4、成功构建重组腺病毒Ad-EPO。Ad-EPO感染SGNs48h、MOI 150时Ad-EPO感染效率与GFP阳性反应趋于稳定平台期,确定感染倍率为MOI 150、感染48小时为时相点。5、免疫荧光检测EPO在部分螺旋神经元中表达,红色荧光为阳性表达。Ad-EPO转染细胞48h后,EPO的mRNA、蛋白表达明显升高,转染组与对照组比较差异有显着意义（P<0.05）。提示转染腺病毒载体后的EPO在螺旋神经元中过表达。谷氨酸浓度为50,75,100μmol/L组,经腺病毒转染后的细胞活性,与对照组相比,Ad-EPO转染组中细胞活性明显提高,差异有显着意义（P<0.05）。提示腺病毒转染后,可以拮抗谷氨酸造成的损伤影响。TUNEL法对细胞凋亡率检测的结果提示,Glu浓度为50,75,100μmol/L组,Ad-EPO转染组的细胞凋亡率明显下降,差异有显着意义（P<0.01）。Caspase-3法得到相似结果。提示转染EPO腺病毒后,可以有效抑制其兴奋性损伤中细胞凋亡。6、构建靶向EPO重组shRNA表达载体pGenesil-EPO,并成功将EPO siRNA转染到体外培养的螺旋神经元中,转染干扰载体后,下调了螺旋神经元中的EPO表达水平,Glu浓度为50,75,100μmol/L组中,与对照组相比,EPO siRNA组细胞活性、凋亡率均分别差异有非常显着意义（P<0.01）。Caspase-3法检测结果类似。结果提示转染RNA干扰病毒载体后,EPO下调表达,进一步加重了细胞活性下降及SGNs兴奋毒性所致凋亡。7、采用荧光定量PCR和Westernblot方法测定pAKT、FOXO3a、GSK-3β等几个主要分子表达,通过抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt信号通路加重这种损伤,表明该信号通路参与了Glu对SGNs的损伤调控。转染Ad-EPO后,上调了SGNs细胞内的EPO表达水平,对Glu造成的螺旋神经元损伤可以获得保护效应。此时pAKT、FOXO3a、GSK-3β等几个主要分子的表达发生逆转,并可以拮抗LY294002进一步加重的Glu所致兴奋毒性损伤。结论1、EPO及EPO-R在大鼠内耳中SGNs、血管纹、Corti器中均有表达,主要位于细胞膜、胞浆与胞质。2、成功培养大鼠SGNs并鉴定证实,确定损伤的最适Glu浓度及作用时间,同时检测其细胞相关活性与凋亡指标,成功构建了谷氨酸所致兴奋毒性损伤的体外模型。3、构建EPO重组腺病毒载体的并转染到体外培养的大鼠SGNs中,证明外源性腺病毒基因转染上调EPO蛋白表达对兴奋毒性损伤所致螺旋神经元的凋亡有神经保护作用。4、构建靶向EPO重组shRNA表达载体pGenesil-EPO,并成功将EPO siRNA转染到体外培养的螺旋神经元中,下调了螺旋神经元中的EPO表达水平,加重SGNs因兴奋毒性损伤导致的凋亡。5、测定PI3K/Akt信号通路中主要分子相对表达水平变化,结果提示PI3K/Akt信号通路参与了EPO对谷氨酸所致螺旋神经元兴奋毒性损伤的神经保护作用调控机制。
秦贺[2]（2010）在《骨髓间充质干细胞治疗药物性聋的基础研究》文中认为感音神经性聋主要由耳蜗毛细胞或听觉神经病变引起。毛细胞位于耳蜗内,是高度特异性机械感受器,其功能障碍、损伤甚至缺失是耳蜗病变引起感音神经性聋的主要原因。相对于非哺乳动物,哺乳动物毛细胞损伤后不能自发再生,由此引起的听力损失难以恢复。应用干细胞进行细胞替代治疗是毛细胞缺失后恢复听力的一个主要治疗策略。骨髓间充质干细胞易于收集和增殖、能够自体移植、无临床应用伦理问题和免疫障碍,具有多潜能性,是目前进行干细胞替代治疗的主要干细胞来源。体外研究显示骨髓间充质干细胞在一定细胞蛋白作用下具有很强的可塑性,能够分化为神经元细胞类型。但是,骨髓间充质干细胞能否分化为内耳毛细胞或前体细胞,干细胞移植到内耳能否存活和分化,能否替代损伤的听毛细胞,这些都还不清楚。本课题对大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化耳蜗毛细胞和骨髓间充质干细胞内耳导入正常和药物性聋耳蜗内的存活和分化情况进行了研究。本研究共分为两部分：第一部分骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞目的：探讨骨髓间充质干细胞体外定向分化为耳蜗毛细胞的可行性。方法：1、体外分离培养骨髓间充质干细胞,观察不同换液方式对骨髓间充质干细胞纯化和增殖的影响；RT-PCR检测培养细胞表面分子表达；定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。2、采取不同细胞诱导因子定向诱导培养骨髓间充质干细胞地向分化为内耳毛细胞,培养后细胞进行免疫组化鉴定和扫描电镜观察。结果：1、24小时首次半量换液可使分离细胞在7天内迅速增殖铺满细胞培养皿,培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达,但不表达CD34,培养细胞可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。2、体外骨髓间充质干细胞诱导后呈现神经干细胞样形态并表达其特异性标志Nestin,继续诱导分化表达内耳毛细胞特异性标志MyosinⅦa,电镜观察可见细胞表面长出微绒毛,类似毛细胞的静纤毛。结论：1、24小时首次半量换液培养有利于大鼠骨髓间充质干细胞的分离和纯化,培养细胞证实为骨髓间充质干细胞。2、骨髓间充质干细胞体外可定向诱导分化为内耳毛细胞样细胞。第二部分骨髓间充质干细胞内耳移植治疗药物性聋目的：1.探讨用于干细胞替代治疗研究的感音神经性聋动物模型的建立方法；2.观察骨髓间充质干细胞移植对正常耳蜗的影响；3.研究骨髓间充质干细胞移植到药物性聋耳蜗内的存活和分化情况。方法：1、应用不同剂量阿米卡星连续1周,通过听觉脑干反应阈值、耳蜗常规切片和扫描电镜观察,确定适合用于骨髓间充质干细胞移植的感音神经性聋大鼠动物模型。2、经鼓阶途径将骨髓间充质干细胞移植到正常听力大鼠耳蜗内,通过听觉脑干反应阈值、耳蜗常规切片观察骨髓间充质干细胞移植对耳蜗结构和功能的影响。3、经鼓阶途径将骨髓间充质干细胞移植到药物性聋大鼠耳蜗内,通过听觉脑干反应阈值、免疫组化和扫描电镜观察植入细胞对感音神经性聋听功能的影响及植入细胞在耳蜗内的分化情况。结果：1、应用阿米卡星按500mg·kg-1·d-1进行连续一周皮下注射,可造成大鼠听觉永久性阈移,3周后观察柯替器毛细胞缺失,支持细胞损伤,呈现立方上皮样结构。2、骨髓间充质干细胞鼓阶导入对正常大鼠听功能和耳蜗结构无明显影响,可在鼓阶和前庭阶内贴壁或游离存活至少4周。3、骨髓间充质干细胞移植到药物性聋动物耳蜗内可迁移到耳蜗基底膜处并具有听毛细胞特征,移植后8周听功能大多无明显改善。结论：1、应用阿米卡星可以建立起适合骨髓间充质干细胞替代治疗的理想动物模型。2、骨髓间充质干细胞移植适合进行耳蜗病变的替代治疗。3、骨髓间充质干细胞移植到药物性聋耳蜗内可以存活定位于基底膜外毛细胞区域,表现内耳听毛细胞特征。
刘晓薇[3]（2008）在《豚鼠神经干细胞体外分化毛细胞样细胞及耳蜗移植的实验研究》文中认为第一部分豚鼠神经干细胞的分离、培养、鉴定目的建立豚鼠神经干细胞体外培养的模型,为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋创造基础。方法取刚出生的豚鼠靠近海马区的脑组织,体外于无Ca、Mg的D-Hank‘s溶液中进行分离,单细胞悬液置于含有20% B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF的培养基中悬浮培养。用Nestin免疫细胞化学法及免疫荧光鉴定神经干细胞,传代培养。结果所取的胎鼠细胞组织细胞可形成集落样生长的神经干细胞团,Nestin免疫细胞化学染色阳性,但是不表达Brn-3c和myosinⅦa。结论小鼠的神经干细胞可经体外分离纯化,建立细胞系,具有明显的增殖能力可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的供体细胞。第二部分豚鼠神经干细胞体外诱导分化毛细胞样细胞目的体外诱导豚鼠神经干细胞向毛细胞样细胞分化,初步探讨神经干细胞移植治疗感音神经性聋的可行性。方法取纯化的豚鼠神经干细胞,置于含有20% B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、TGF-α、IGF-Ⅰ、10% FBS的DMEM/F12培养基中贴壁培养,四周后,免疫组化鉴定毛细胞特异表型myosinⅦa,pan-cytokeratin。结果培养细胞经免疫组化鉴定表达出毛细胞的特异性标记抗体myosinⅦa,pan-cytokeratin。结论神经干细胞可经体外分离纯化向毛细胞分化,并表现出毛细胞的特异性表型,这可能为神经干细胞移植治疗感音神经性聋提供基础。第三部分神经干细胞噪音性聋豚鼠内耳移植初步观察目的:研究神经干细胞（Neural stem cells, NSC）移植入豚鼠耳内存活以及迁移情况。方法豚鼠用白噪声制成神经性耳聋模型,取原代培养的神经干细胞,用Hoechst33342进行荧光素标记,在豚鼠内耳损伤后即刻移植入损伤耳内,移植后7～10天处死豚鼠,观察细胞标记荧光情况。处死前分别行ABR及40Hz诱发电位检测。结果神经干细胞在豚鼠的内耳中可以存活并沿着注射部位的骨壁生长结论神经干细胞移植入噪声性耳聋豚鼠的耳内可存活,并沿着注射的部位向上迁移生长,为进一步研究神经干细胞在体内的分化和表达奠定了基础。
杨阳[4]（2008）在《MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护》文中研究表明第一部分病毒与非病毒载体转导大鼠耳蜗组织细胞的研究目的通过病毒与非病毒载体对胎鼠耳边缘细胞和耳蜗组织转染情况的研究,选择出合适的内耳基因治疗载体。方法分别用质粒（pEGFP-N1）、腺病毒（rAd5-EGFP）以及腺相关病毒（rAAV2- EGFP）载体转导原代培养的新生Wistar大鼠（≤72小时）耳边缘细胞或经圆窗膜将病毒液注入鼓阶外淋巴液,通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、CCK-8、免疫组化（SP法）、免疫组化（ApopTag过氧化物酶凋亡检测）、Westernblot及ABR检测方法对三种载体加以比较。结果三种载体对原代培养的大鼠耳边缘细胞的转染研究发现,腺病毒的转染效率最高,而腺相关病毒转染对细胞活性影响最小。rAAV2和rAd5对大鼠耳蜗组织的感染实验发现,腺病毒和腺相关病毒携带的增强型绿色荧光蛋白可在多种耳蜗组织中及转染对侧耳蜗组织表达,且并不引起明显的耳蜗组织细胞凋亡。rAAV2携带的EGFP基因在第90天时仍可检测到大量表达。rAd5携带的EGFP基因在第30天时表达明显减弱。结论病毒载体相对于非病毒载体以其高的转导效率、低细胞毒性在对原代培养的胎鼠耳边缘细胞的转导中表现出明显优势。在病毒载体对大鼠耳蜗组织感染研究方面,腺病毒载体的优势在于其携带的基因表达迅速而高效,而腺相关病毒载体则以其长表达时程,低组织毒性见长。第二部分重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达目的构建含有大鼠源性锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase, MnSOD）基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并检测其在大鼠耳血管纹边缘细胞和耳蜗组织内的表达。方法将大鼠心肌组织来源的SOD基因克隆入融合表达载体pEGFP-N1中,再以限制性酶切方法克隆入真核表达载体pSNAV2.0-IRES-EGFP中,最后将其包装为rAAV2- IRES-EGFP/MnSOD病毒颗粒,用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、PCR及Westernblot检测MnSOD基因的表达。结果真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD和pSNAV2.0-IRES-EGFP/MnSOD经酶切、PCR和测序鉴定均检测到MnSOD基因的完整序列,被rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD感染的耳边缘细胞和内耳组织中MnSOD蛋白的表达均高于空白对照耳。结论成功构建了大鼠源性MnSOD基因重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并使其在大鼠耳边缘细胞和大鼠耳蜗组织中成功表达,为抗氧化基因治疗内耳疾病的研究奠定了基础。第三部分MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护目的探讨锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）基因内耳注射对氨基糖甙类抗生素造成的拟老化大鼠内耳损伤的干预性保护作用。方法在半乳糖注射的第6周（注射氨基糖甙类抗生素之前2周）将rAAV2-IRES- EGFP/MnSOD病毒液经圆窗膜注入拟老化大鼠的耳蜗外淋巴,通过免疫组化（ApopTag过氧化物酶凋亡检测）、Westernblot及MnSOD活性检测的方法观察MnSOD基因在对抗内耳氧化应激损伤中的干预性保护作用。结果MnSOD基因的干预性注射,感染有效地减少了氧化应激引起的拟老化大鼠内耳细胞凋亡,有效地提升了内耳中MnSOD的活性,并在一定程度上缓解了氨基糖甙类抗生素造成的拟老化大鼠的听力损失。结论外源性MnSOD基因在内耳过表达能部分对抗氨基糖甙类抗生素对拟老化大鼠内耳的损伤。
王斌[5]（2008）在《地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究》文中提出噪声性聋及药物性聋是常见的感音神经性聋,严重影响人们的生活质量。长期以来,对声损伤和庆大霉素耳毒性的防治一直是广大耳科工作者致力研究的课题。地塞米松作为合成的糖皮质激素,具有多种生理功能。已有研究发现,地塞米松能减小噪声及氨基甙类药物的耳毒性,但对这一现象机制的研究少有报道。地塞米松作为糖皮质激素,通过基因组途径及非基因组途径发挥作用。在基因组途径中,地塞米松通过与位于胞浆的糖皮质激素受体（Glucocorticoidreceptor,GR）结合,进而影响某些基因的转录与表达,因此了解GR在耳蜗的的分布很有必要。既往的研究应用酶联免疫吸附试验（ELISA）、原位杂交、免疫组织化学方法研究糖皮质激素在内耳的分布,而应用直观的免疫荧光技术分析GR在耳蜗的分布及声损伤对GR表达的影响还未见报道。Notch信号系统几乎涉及所有细胞的增殖、分化活动,Hes1（hairy andenhancer of split 1）为Notch的基本效应因子。Hes1 mRNA表达水平增高提示Notch信号活化,导致CDK（Cyclin-dependent kinases,周期性蛋白依赖激酶）抑制物p21Wafl/ Cip的聚集,而后者与细胞凋亡密切相关。噪声、地塞米松与hes1mRNA表达的关系可能是地塞米松拮抗声损伤的机制之一,对这一现象未见相关报道。地塞米松拮抗氨基甙类抗生素耳毒性的在体研究已有报道,离体实验避免了全身因素的干扰和影响,使研究途径更加便捷可靠。观察地塞米松是否拮抗庆大霉素对体外培养的Corti器的耳毒性,尚未见报道。抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流可能是氨基甙类抗生素耳毒性的机制之一,地塞米松是否通过非基因组途径影响该电流,从而拮抗庆大霉素耳毒性,尚未见报道。因此,本研究的主要目的是探讨地塞米松对声损伤及庆大霉素耳毒性的影响及相关机制。以免疫荧光技术定位,荧光强度半定量分析为指标,探讨了糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布,声损伤后对其分布及各区域表达强度的影响。以听觉脑干诱发电位（ABR）,耳蜗形态学为指标探讨地塞米松减轻耳蜗声损伤的作用;用RT-PCR及荧光实时定量PCR技术,探讨噪声及地塞米松对豚鼠耳蜗hes1mRNA表达水平的影响。以免疫荧光技术定位,耳蜗形态学毛细胞计数为指标,探讨地塞米松减轻庆大霉素对离体培养的耳蜗Corti器的毒性作用。以听觉脑干诱发电位（ABR）为指标探讨地塞米松减轻庆大霉素耳毒性的作用;应用全细胞膜片钳记录技术探讨庆大霉素耳毒性及地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的离子通道机制。第一部分地塞米松拮抗内耳声损伤的实验研究一、糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对其表达的影响目的:研究GR在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对豚鼠耳蜗GR表达的影响。方法:豚鼠随机分为二组:实验组予噪声暴露,噪声为白噪声,强度115dBSPL,暴露时间3h。暴露结束后2h断头剥取耳蜗。正常对照组不做处理,与实验组同时剥取耳蜗。制备耳蜗冰冻切片,免疫荧光技术观察豚鼠耳蜗GR表达情况,并进行荧光强度半定量分析。结果:（1）豚鼠耳蜗GR主要的阳性部位在螺旋韧带、血管纹、骨螺旋唇、Corti器以及螺旋神经节。螺旋韧带、血管纹、骨螺旋唇以及螺旋神经节等区域GR荧光强度无明显统计学意义（P＞0.05）,而上述各区域与Corti器的GR荧光强度相比,差异有显着意义（P＜0.05）。（2）声损伤后豚鼠耳蜗GR荧光强度在骨螺旋唇、corti器以及螺旋神经节较正常对照组无统计学意义（P＞0.05）,而螺旋韧带、血管纹区域荧光强度较正常对照组明显减低,有显着统计学意义（P＜0.01）。结论:GR在豚鼠耳蜗分布于螺旋韧带、血管纹、corti器和螺旋神经节,其中螺旋韧带、血管纹区域表达最强,corti器区域表达最弱;声损伤降低耳蜗各区域GR的表达,以血管纹、螺旋韧带最显着。二、地塞米松拮抗耳蜗声损伤及对豚鼠耳蜗hes1表达水平的影响目的:探讨地塞米松拮抗声损伤及与耳蜗hes1 mRNA的表达的关系。方法:在预实验的基础上,豚鼠随机分为5组,空白对照组,NS ip qd+植物油im qd;噪声组（N）,NS ip qd+植物油im qd+噪声暴露;地塞米松+噪声组（Dex+N）,Dex ip qd+植物油im qd+噪声暴露;RU486+噪声组（RU+N）,NS ip qd+RU486 im qd+噪声暴露;地塞米松+RU486+噪声组（Dex+RU+N）,Dex ip qd+RU486 im qd+噪声暴露。其中地塞米松剂量1mg/kg,浓度0.5mg/ml;RU486剂量20mg/kg,浓度25mg/ml。药物作用时间均为5d。噪声暴露于白噪声3小时,强度115dB SPL。噪声暴露结束即刻处死。取下颞骨,冰盒中取出耳蜗,用荧光实时定量PCR（real-time-PCR）检测耳蜗组织hes1 mRNA的表达。同样分组条件下,在噪声暴露前、噪声暴露结束后24小时测定Click和短纯音（2、4、6、8kHz）ABR反应阈值,空白对照组在实验开始和结束各测定一次ABR。各组动物进行耳蜗NBT染色及基底膜铺片。结果:（1）白噪声115dB SPL,暴露3h,促进豚鼠hes1 mRNA表达增加约3倍;地塞米松预处理5d,可以使hes1 mRNA表达水平接近于对照组。Dex-RU486-noise组hes1 mRNA表达水平接近于noise组,说明RU486基本上阻断了地塞米松下调豚鼠耳蜗hes1 mRNA表达水平的作用。（2）各组ABR平均阈移:空白对照组阈移为0.5～1.40dB;噪声组click阈移为29.56dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为32.75～34.78dB;地塞米松+噪声组click阈移为11.46dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为12.75～15.85dB;RU486+噪声组click阈移为26.93dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为30.15～33.26dB;地塞米松+RU486+噪声组click平均阈移为27.38dB,短纯音2、4、6、8kHz阈移为30.26～33.52dB。噪声组、地塞米松+RU486+噪声组分别与地塞米松+噪声组相比,全频的ABR阈移均有显着性差异（p＜0.05）。（3）耳蜗基底膜NBT染色显示噪声组底回损伤较重,地塞米松+噪声组损伤轻微。结论:地塞米松对耳蜗声损伤具有拮抗作用;下调耳蜗hes1 mRNA的表达水平,减少细胞凋亡,可能是地塞米松对声损伤发挥保护作用的机制之一。第二部分地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的实验研究一、地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的离体实验研究目的:采用Corti器体外培养的方法,观察地塞米松是否对庆大霉素的耳蜗毒性具有拮抗作用。方法:成功建立耳蜗Corti器体外培养系统后,选取出生3d的SD大鼠,随机分为3组,正常对照（Control）组,进行Corti器体外培养,72h后中止培养;庆大霉素（GM）组,培养48h后加入庆大霉素液（浓度0.5mmol/L）,作用24h后中止培养;地塞米松+庆大霉素（Dex+GM）组,培养24h后加入地塞米松溶液（浓度100ng/mL）,培养48h后加入庆大霉素液（浓度0.5mmol/L）,培养72h后中止培养。各组中止培养后,Rhodamine-phalloidin染色,免疫荧光技术观察Corti器毛细胞生长状况。结果:正常对照（Control）组毛细胞无明显缺失;庆大霉素（GM）组外毛细胞有明显缺失,而内毛细胞基本无明显改变,三排外毛细胞中以内两排损害较重;地塞米松+庆大霉素（Dex+GM）组可见外毛细胞的缺失程度明显减轻,内毛细胞基本无明显改变。结论:地塞米松预处理对离体耳蜗Corti器的庆大霉素耳毒性具有拮抗作用。二、地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的电生理学研究目的:探讨地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的离子通道机制。方法:（1）豚鼠随机分为6组,生理盐水（control）组,生理盐水0.5ml,ip;庆大霉素（GM）组,庆大霉素80mg/kg,im;地塞米松低浓度（Dex-1）组,地塞米松0.2mg/kg ip;地塞米松高浓度（Dex-h）组,地塞米松1mg/kg ip;地塞米松低浓度+庆大霉素（Dex-1+GM）组,地塞米松0.2mg/kg ip,庆大霉素80mg/kg,im;地塞米松高浓度+庆大霉素（Dex-h+GM）组,地塞米松1mg/kg ip,庆大霉素80mg/kg,im。给药前及给药结束后,测定ABR反应阈,计算ABR阈移。（2）全细胞膜片钳技术记录单离外毛细胞钙敏感外向钾电流。分别观察0.1、1、10、100、1000umol/L庆大霉素对钙敏感外向钾电流的影响;全细胞膜片钳技术记录单离外毛细胞钙敏感外向钾电流。分别观察0.1、1、10、100、1000umol/L地塞米松对钙敏感外向钾电流的影响。结果:（1）生理盐水（control）组、Dex-1组和Dex-h的ABR平均阈移很小,为1.0～1.6dB;GM组click平均阈移为10.6dB,短纯音在5.0～21.0dB之间,并以6kHz及8kHz的阈移最为明显;Dex-1+GM组Dex-h+GM组click平均阈移为5.8～7.2dB,短纯音在2.5～5.2dB之间,与GM组相比有显着性差异（p＜0.05）。（2）庆大霉素以浓度依赖性方式抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流;地塞米松以浓度依赖方式增大外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流。结论:地塞米松能够显着降低庆大霉素对豚鼠的耳毒性,并且对豚鼠听功能没有明显影响;庆大霉素抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流,可能是急性耳中毒的机制之一;地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的作用可能是通过激活外毛细胞Ca2+敏感的外向K+通道的非基因组效应实现的。
李元涛[6]（2007）在《异氟醚对大鼠耳蜗和豚鼠耳蜗外毛细胞作用的初步研究》文中研究指明对于全身麻醉来说,麻醉药物作用部位是从脊髓到大脑皮层这一段广阔的区域,包括传入神经、传出神经、神经中枢的多种神经元。研究表明全麻药物对外周神经系统中外周伤害性感受器、神经轴传导几乎没有任何作用,但现已证实对神经突触有明显作用,如多数吸入全麻药可对兴奋性突触传递产生抑制,而抑制性突触传递产生增强作用。听觉的传导路径比较复杂,声波传入内耳,刺激耳蜗螺旋器,使耳蜗毛细胞兴奋,并以神经冲动形式经听神经传向大脑皮层听觉中枢（auditory center）,产生听觉。听觉是全身麻醉中最后消失的一个感觉,也是清醒时恢复的第一感觉;视觉和本体感觉等很容易被全麻药物所抑制,而听觉在麻醉中并不是突然消失的,随着麻醉程度的加深逐渐被抑制。在全身麻醉中听觉系统除了听皮层、听性脑干受到抑制外,全麻药物对外周感受器耳蜗的作用至今仍不清楚。目前关于全麻后听力损害的报道越来越多,发生机制不清楚。那么全麻药物是否与耳毒性药物（如链霉素、顺铂、水杨酸钠等）一样,可以使耳蜗基因表达发生变化,进而形态学发生病理学改变导致耳损害?基于以上两点原因,本研究通过观察异氟醚和氧化亚氮对大鼠耳蜗总RNA的影响、异氟醚对大鼠耳蜗一氧化氮合酶活性的影响,以及对异氟醚豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子浓度变化的影响,初步了解吸入麻醉药对耳蜗的作用机制。本课题共分三部分:第一部分异氟醚和氧化亚氮对大鼠耳蜗总RNA提取和含量的影响目的通过检测吸入麻醉药异氟醚（Isoflurane）、氧化亚氮（N2O）对大鼠耳蜗总RNA含量的影响,探讨异氟醚、氧化亚氮对大鼠内耳有无损害作用以及耳损害的可能机制。方法30只健康Wistar大鼠随机等分为三组:C组（对照组,n=10）持续吸入50%氧气（O2） 3小时;N组（实验组,n=10）持续吸入50% N2O+50% O2 3小时;I组（实验组,n=10）持续吸入2.5%异氟醚3小时。然后将所有大鼠断头处死,取出双侧听泡,剥离耳蜗,各组标本编号记录后分开液氮低温保存。联用TRIzol和RNeasy法分别抽取三组大鼠耳蜗的总RNA,用分光光度法测总RNA的含量及电泳检测其质量。结果检测C组大鼠耳蜗得到总RNA含量7.69μg;N组大鼠耳蜗得到总RNA含量6.51μg,与C组相比减少15%;I组大鼠耳蜗得到总RNA含量7.32μg,与C组相比几乎没变化。C组、N组和I组的A260/A280值分别为2.07、2.04和2.04,提示RNA纯度高;电泳结果提示总RNA无降解。结论吸入氧化亚氮的大鼠耳蜗总RNA较正常大鼠耳蜗总RNA含量降低,而吸入异氟醚的大鼠耳蜗总RNA含量无明显变化。提示氧化亚氮干扰耳蜗RNA含量,使大鼠耳蜗基因表达发生变化可能是造成耳损害的原因之一,而异氟醚对耳蜗RNA含量没有明显影响。第二部分异氟醚麻醉对大鼠耳蜗一氧化氮合酶活性的影响目的通过观察不同浓度的吸入麻醉药异氟醚（Isoflurane）对大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内各型NOS（nitric oxide synthase）活性的影响,探讨吸入麻醉药对大鼠听觉系统外周感受器的可能作用机制。方法30只健康Wistar大鼠随机等分为三组:C组（对照组,n=10）持续吸入O2 30分钟;I1组（实验组,n=10）持续吸入1.5%异氟醚+O2 30分钟;I2组（实验组,n=10）持续吸入3.0%异氟醚+O2 30分钟。待各组动物实验时间完成后,立即断头处死,迅速取出听泡。充分暴露耳蜗后,在解剖显微镜下刺破蜗窗及前庭窗,蜗尖钻孔并缓慢注入含4%多聚甲醛固定,脱钙后标本制作石蜡切片。HE染色观察各组大鼠耳蜗组织学改变;用免疫组织化学方法检测各组大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内诱生型NOS（iNOS）、内皮型NOS（eNOS）、神经元型NOS（nNOS）的表达,采用Motic image advance图像分析仪,分别测量各组大鼠耳蜗组织不同部位NOS平均灰度值;灰度值越小,表示阳性反应越强。以观察不同浓度异氟醚麻醉对大鼠耳蜗NOS活性的影响。结果HE染色观察各组大鼠耳蜗Corti器毛细胞无损伤,血管纹清晰,螺旋神经节结构正常。C组大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内各型NOS均有强弱不等的阳性表达;与C组比较,I1组大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内各型NOS阳性表达均有减弱、各型NOS平均灰度值均有升高趋势,除血管纹iNOS外其余均有显着性差异（P<0.05）;与C组比较,I2组大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内各型NOS阳性表达进一步减弱、各型NOS平均灰度值升高明显（P<0.05）,其中以螺旋神经节各型NOS平均灰度值升高显着（P<0.01）;与I1组比较,I2组大鼠耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节内各型NOS阳性表达减弱、各型NOS平均灰度值升高趋势,但除螺旋神经节中eNOS、nNOS外其余均没有显着性差异（P>0.05）。结论吸入异氟醚麻醉大鼠耳蜗NOS活性较正常大鼠耳蜗降低,且耳蜗NOS活性降低程度与吸入异氟醚浓度呈正相关。推测异氟醚可抑止耳蜗Corti器、血管纹、螺旋神经节NOS活性,减少NO（nitric oxide）产生,从而抑止听觉外周感受器功能。第三部分异氟醚对豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子浓度变化的影响目的观察不同浓度异氟醚对氯化钾和咖啡因诱发的豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子移动的影响,探讨其对听觉外周感受器（耳蜗）作用的可能机制。方法采用酶孵育后机械分离法急性分离豚鼠耳蜗外毛细胞,在倒置相差显微镜下观察外毛细胞的形态,辨认其活性。用Fluo-3AM荧光指示剂染色活性良好的豚鼠耳蜗外毛细胞,在激光共聚焦显微镜下动态观察使用异氟醚预处理前及不同浓度异氟醚即1.0最低肺泡有效浓度（minimal alveolar concentration,MAC）、2.0MAC预处理后,用氯化钾和咖啡因诱发的耳蜗外毛细胞内钙荧光强度的变化,记录5min荧光强度峰值;并用激光共聚焦图形分析软件Profile功能测各细胞内的荧光强度进行分析,从而了解异氟醚预处理前、后对氯化钾和咖啡因诱发的耳蜗外毛细胞内钙离子浓度的变化的影响。结果异氟醚可使氯化钾诱发的外毛细胞内钙荧光染色强度的峰值下降,较对照组有明显差异,并且降低程度与异氟醚的浓度呈正相关。但该两种浓度的异氟醚对咖啡因诱发的外毛细胞内钙荧光染色强度升高无明显影响。结论异氟醚浓度依赖性地降低耳蜗外毛细胞内钙离子浓度,可能部分与抑止细胞外钙内流有关,而对肌浆网内钙离子移动无明显影响。
周净洁[7]（2006）在《螺旋神经节神经元的切割分离法培养》文中研究指明目的建立一种简单而且稳定可靠的分离鼠耳蜗螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的培养方法。方法根据SGNs分离的方法不同分为切割分离法组（A组）、消化法组（根据消化酶的种类、酶消化的时间不同再分为B、C、D组）。A组把分离得到螺旋神经节组织块,剪切成相同的8-10块后接种到已用多聚赖氨酸包被的35mm培养皿中培养。消化法把分离得到的螺旋神经节组织块移到装有D-Hanks溶液的4ml的离心管中, B组加入0.25%胰蛋白酶+0.001%DNas的消化酶溶液溶液,在37℃作用20分钟后,加入含血清的培养液中止消化,1000rpm离心5分钟,弃上清,加入含血清的培养基轻轻的吹打后接种培养,其他步骤与A组相同。C组单用含0.25%胰蛋白酶的消化酶溶液,作用20分钟。D组,用0.25%胰蛋白酶+0.001%DNas的消化酶溶液溶液,作用30分钟,其余操作与B组相同。倒置显微镜下观察比较各组培养SGN细胞的活力以及生长与分化过程。对SGNs神经元进行免疫细胞化学染色鉴定。结果A组培养的神经细胞、神经突起生长良好,细胞存活时间1-2周。B组分离培养的神经细胞总数与A组差别不显着,神经突起生长的长度比A组短。C、D组培养1周后,神经细胞总数比A组少,存活时间较A组短,神经突起生长比A组短。结论成功建立了切割分离法分离与培养螺旋神经节细胞的方法,与消化法相比,其操作简单,可以取得酶解组织同样的效果,满足体外多种实验的需要。
宋巍[8]（2005）在《大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定》文中研究指明普遍认为噪音,耳毒性药物,老化以及各种疾病引起的毛细胞的缺失,变性,损伤是感音神经性聋的主要原因。但是毛细胞是位于内耳感觉上皮的终末分化细胞,以往的研究表明哺乳类耳蜗毛细胞损伤后是不能再生的。长期以来人们为了探讨毛细胞发育、分化、再生的机制而进行了不懈的努力,刺激毛细胞的再生从而修复受损的听力及平衡障碍一直是研究的主要方向。 再生可能是重复正常发育中的毛细胞分化的过程。因此,理解毛细胞的分化有助于毛细胞再生的研究。哺乳类前庭毛细胞的发生也以与低等脊椎动物相似的方式源自感觉上皮内的前体细胞和支持细胞,但哺乳类耳蜗毛细胞的确切起源还不清楚,组织学研究表明内、外毛细胞在胚胎发育过程中可能分别起源于大、小上皮嵴。 最近,大上皮嵴（greater epithelial ridge,GER）成为哺乳动物毛细胞再生研究的一个新热点。研究表明,大上皮嵴很可能是毛细胞的前体细胞群之一。毛细胞分化的正性调控基因Math1在体外培养的大鼠耳蜗中过度表达后,能诱导大上皮嵴形成大量新生毛细胞。一些参与毛细胞分化和再生的重要基因和生长因子受体如P27、Hes1、Math1和FGFR1等在不同时期的大上皮嵴表达,这些研究结果都表明大上皮嵴在毛细胞的分化和再生过程中起着重要的作用,是重要的细胞群,有可能是耳蜗毛细胞的前体细胞池之一。目前对大上皮嵴了解的不多,本课题的目的在于探讨利用酶消化和机械解剖相结合的方法分离出有活性的大上皮嵴。通过形态学比较,免疫组织化学染色,RT-PCR对所分离的大上皮嵴进行鉴定,原代培养以验证分离的大上皮嵴活性。 一、大鼠耳蜗大上皮嵴的分离 选取出生后0天的SD大鼠耳蜗,取出基底膜,将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank’s溶液中,37℃孵箱孵育25分钟进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行机械分离。经过酶的作用后,耳蜗上皮组织和结缔
冯悦[9]（2004）在《丹参、川芎嗪对低气压环境下噪声性听器损伤的防护作用及机理研究》文中研究表明本研究模拟高原环境下低气压条件下噪声性工作环境，探讨豚鼠在低气压环境下噪声对听器的损害作用；并通过丹参、川芎嗪的应用，观察药物在体液中的分布，以及其对低气压及噪声环境下听器损害的防护效果，探讨其作用机制。为低气压噪声性听器损伤的早期防治研究提供实验基础。 一、高效液相色谱法测定豚鼠血液、脑脊液和外淋巴液中的丹参素、川芎嗪 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法是常用的体内化学成分测定方法。本实验采用HPLC测定豚鼠肌注丹参注射液、盐酸川芎嗪注射液后，其主要的有效成分丹参素、川芎嗪在豚鼠血液、脑脊液、耳蜗外淋巴液中的吸收和分布情况。 结果： 1．豚鼠肌肉注射丹参注射液10min后血液中很快可检测到丹参素，80min在豚鼠的血液中丹参素含量达到最大值，585.84mg 第四军医大学博十学位论文/L。6h后血药浓度下降到可检测水平之下。而在耳蜗液和脑脊液中，始终未能检测到。表明药物主要是通过血液循环起作用。 2.豚鼠肌肉注射盐酸川芍嗦后在血液、脑脊液和耳蜗外淋巴液中可检测到川芍嗦的时间分别为smin、10min和smin:达到最大值的时间分别为ZOmin、20min和50 min;下降到可检测水平之下的时间分别为Zh、70 min和Zh。因此，肌肉注射后吸收快，能迅速进入机体，通过血脑屏障、血迷路屏障，进入脑脊液和耳蜗外淋巴液。 二、丹参对低气压环境下豚鼠噪声性听器损伤的防护作用及机理研究 实验模拟高原5500m高度，并给以1 IOdBSPL白噪声刺激，通过检测听性脑干反应（audst。ry brainstem response，ABR）闽移值，观察丹参对低气压及噪声环境下听闽阂移的影响;采用耳蜗铺片、诱生型一氧化氮合酶（indueible nitrie oxide Synthase，iNOS）、免疫组化染色及透射电镜等技术，观察丹参对低压及噪声环境下豚鼠耳蜗形态学变化的影响;检测血清中脂质过氧化的终产物丙二醛（MDA）含量及超氧阴离子自由基清除剂超氧化物歧化酶 （s0D）活性在听器损伤过程中的变化情况;测定血粘度的特点和变化规律，探讨低气压噪声环境下豚鼠噪声性听器损伤可能的机理以及丹参防治的意义。 结果: 1.丹参对低气压及噪声环境下豚鼠听阐改变的影响 暴露后各组豚鼠都出现不同程度的闽移;以4kHz处闽移最明显;闽移值随着低压噪声环境暴露时间的延长而增加:丹参注射液对低压及噪声暴露的豚鼠的听阖闭移具有一定防治作用。 2.丹参对低气压噪声环境下豚鼠听器损伤的形态学观察 （1）耳蜗铺片见低压噪声暴露后外毛细胞缺损较内毛细胞明显，阳性对照组的损伤较防治组与治疗组重。暴露7天组较暴露 第四军医人学博士学位论文1天组损伤重。 （2）正常耳蜗未见iNOS阳性表达。低压嗓声暴露后豚鼠耳蜗外毛细胞、内毛细胞、血管纹及螺旋神经节等部位均可见iNOS呈棕黄色颗粒的阳性反应。耳蜗iNOS阳性反应随暴露时间延长逐渐增强。各组染色随出舱后时间延长而逐渐减弱。除暴露1天组出舱1天阳性对照组与丹参治疗组差别不显着（p>0.05）外，其它各组间差别均显着（p<0.05）。 （3）透射电镜显示暴露7天组病变较1天组重。低压噪声暴露1天组出舱后7天，阳性对照组表现为毛细胞形态改变，外毛细胞胞浆可见空化、细胞核水肿变大、线粒体结构不清，传入和传出神经末梢空化、线粒体结构不清，神经轴突出现空化，神经健鞘变薄，板层排列紊乱，线粒体靖不清、空化;防治组与治疗组的病变表现较阳性对照组轻。随着出舱后时间的延长，病变逐渐减轻。 3.丹参对低压噪声环境下豚鼠血浆中MDA含量及SOD活性影响 暴露7d组比暴露ld组血清MDA浓度的均数值高，MDA浓度随着在低压噪声环境暴露时间的延长而增加;而血清SOD活性则呈相反趋势，暴露ld组比暴露7d组血清SOD活性的均数值高，暴露后其活性随着随暴露时间的延长而下降;应用丹参注射液可以降低MDA值、提高SOD活性，丹参注射液具有抗脂质过氧化及提高SOD活性作用。 4.丹参对低气压噪声环境下豚鼠血粘度的影响 暴露1天组，出舱后1天全血粘度均数值除正常组与丹参防治组阿全血粘度值差异没有统计学意义外（p>0 .05），其余彼此之间全血粘度值差异均有统计学意义（p<0.05）。出舱7天以后全血粘度谊各组全血粘度均数值组间差别均无统计学意义（坏0.01），基本都恢复正常。说明丹参注射液注射液可防止暴露导致的血粘度增高;攀露1天所引起的血粘度值增高有自然恢复可能，阳性对照组 第四军医大学博十学位论文在出舱7天全血粘度值恢复正常。暴露7天组，暴露后血粘度升高较明显，出舱后1天全血粘度值阳性对照组与丹参治疗组间全血粘度值差异没有统计学意义外（p>0 .05），其余彼此之间全血粘度值差异均显着(p（0 .05）。出舱后7天阳性对照组血粘度值最高，丹参治疗组全血粘度值比丹参防治组全血粘度均数值高，丹参防治组恢复较快。暴露7天组，出舱后7天全血粘度值四组彼此之间差别
冷怀明[10]（2002）在《《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中进行了进一步梳理
二、豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨（论文提纲范文）
（1）EPO对大鼠螺旋神经元损伤保护及其分子机理初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 EPO与EPO-R在大鼠内耳的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 螺旋神经元培养及体外兴奋毒性损伤模型构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 EPO对螺旋神经元兴奋毒性损伤影响的实验研究 |
| 4.1 EPO重组腺病毒载体对螺旋神经元兴奋毒性损伤作用的影响 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 EPO特异性sh RNA对螺旋神经元兴奋毒性损伤作用的影响 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 小结 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 总结 |
| 第五章 EPO对螺旋神经元兴奋毒性损伤影响的分子机理初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 促红细胞生成素在中枢神经系统的神经保护作用及分子机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）骨髓间充质干细胞治疗药物性聋的基础研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞 |
| 第一节 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及初步鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞内耳移植治疗药物性聋 |
| 第一节 阿米卡星对幼年大鼠内耳的毒性作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 骨髓间充质干细胞鼓阶导入内耳后对内耳形态和功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三节 骨髓间充质干细胞移植治疗药物性聋 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）豚鼠神经干细胞体外分化毛细胞样细胞及耳蜗移植的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 豚鼠神经干细胞的分离、培养、鉴定 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 豚鼠神经干细胞体外诱导分化毛细胞样细胞 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 神经干细胞噪音性聋豚鼠内耳移植初步观察 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 病毒与非病毒载体转导大鼠耳蜗组织细胞的研究 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组病毒rAVV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词简表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 地塞米松拮抗内耳声损伤的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对其表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二 地塞米松拮抗声损伤及对豚鼠耳蜗hesl表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的离体实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的电生理学研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 附录 在读期间发表的论文及参加的会议 |
| 致谢 |
（6）异氟醚对大鼠耳蜗和豚鼠耳蜗外毛细胞作用的初步研究（论文提纲范文）
| 一、主要缩写词 |
| 二、中文摘要 |
| 三、英文摘要 |
| 四、前言 |
| 五、正文 |
| 第一部分 异氟醚对大鼠耳蜗总RNA 提取和产量的影响 |
| 一.材料与方法 |
| 二.实验结果 |
| 三.讨论 |
| 四.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 异氟醚麻醉对大鼠耳蜗一氧化氮合酶的影响 |
| 一.材料与方法 |
| 二.实验结果 |
| 三.讨论 |
| 四.结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 异氟醚对豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子浓度变化的影响 |
| 一.材料与方法 |
| 二.实验结果 |
| 三.讨论 |
| 四.结论 |
| 参考文献 |
| 六、总结 |
| 七、综述 |
| 八、在读博士期间发表主要文章 |
| 七、致谢 |
（7）螺旋神经节神经元的切割分离法培养（论文提纲范文）
| 一、英文缩略语简表 |
| 二、摘要 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 三、正文 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 四、综述 |
| 五、附录 |
| 六、致谢 |
| 本研究得到以下基金项目资助 |
（8）大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠耳蜗大上皮嵴的分离 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 大鼠耳蜗大上皮嵴的鉴定 |
| 形态学比较 |
| 免疫组织化学 |
| RT-PCR |
| GER的原代培养 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）丹参、川芎嗪对低气压环境下噪声性听器损伤的防护作用及机理研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 高效液相色谱法测定豚鼠血液、脑脊液和外淋巴液中的丹参素及川芎嗪 |
| 实验一 丹参素在豚鼠血液、脑脊液和耳蜗外淋巴液中的分布 |
| 实验二 川芎嗪在豚鼠血液、脑脊液和耳蜗外淋巴液中的分布 |
| 第二部分 丹参对低气压环境下豚鼠噪声性听器损伤的防护作用及机理研究 |
| 实验一 丹参对低气压噪声环境下豚鼠听阈阈移的影响 |
| 实验二 丹参对低气压噪声环境下豚鼠听器损伤的形态学观察 |
| 实验三 丹参对低气压噪声环境下豚鼠血清中MDA含量及SOD活性影响 |
| 实验四 丹参对低气压噪声环境下豚鼠血粘度的影响 |
| 第三部分 川芎嗪对低气压环境下噪声性听器损伤的防护作用及机理研究 |
| 实验一 川芎嗪对低气压噪声环境下豚鼠听阈阈移的影响 |
| 实验二 川芎嗪对低气压噪声环境下豚鼠听器损伤的形态学观察 |
| 实验三 川芎嗪对低气压噪声环境下豚鼠血清中MDA含量及SOD活性影响 |
| 实验四 川芎嗪对低气压噪声环境下豚鼠血粘度的影响 |
| 全文小结 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
| 附图 |
四、豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨（论文参考文献）
- [1]EPO对大鼠螺旋神经元损伤保护及其分子机理初步研究[D]. 钟诚. 第三军医大学, 2016(06)
- [2]骨髓间充质干细胞治疗药物性聋的基础研究[D]. 秦贺. 中国人民解放军军医进修学院, 2010(09)
- [3]豚鼠神经干细胞体外分化毛细胞样细胞及耳蜗移植的实验研究[D]. 刘晓薇. 安徽医科大学, 2008(05)
- [4]MnSOD基因转染对拟老化大鼠内耳的干预性保护[D]. 杨阳. 华中科技大学, 2008(12)
- [5]地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究[D]. 王斌. 复旦大学, 2008(05)
- [6]异氟醚对大鼠耳蜗和豚鼠耳蜗外毛细胞作用的初步研究[D]. 李元涛. 华中科技大学, 2007(05)
- [7]螺旋神经节神经元的切割分离法培养[D]. 周净洁. 华中科技大学, 2006(03)
- [8]大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定[D]. 宋巍. 中国人民解放军军医进修学院, 2005(06)
- [9]丹参、川芎嗪对低气压环境下噪声性听器损伤的防护作用及机理研究[D]. 冯悦. 第四军医大学, 2004(04)
- [10]《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2002(12)