一、钙粘附蛋白及其在骨组织形成中的研究进展（论文文献综述）
张帆,梁清洋,韩超,刘佳,唐毓金[1]（2021）在《Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞、破骨细胞在骨质疏松中的作用探讨》文中认为骨质疏松症是一种导致骨骼疏松、强度降低、易发生骨骼疼痛和脆性骨折的常见慢性病,影响了全球大部分中老年人健康。目前应用钙剂、维生素D补充剂、双膦酸盐类和雌激素等药物治疗,其主要侧重于预防、延缓骨吸收。针对骨质疏松症需要精准于细胞动力学和分化的靶向治疗药物。通过不断的探索和研究骨质疏松中涉及的信号通路,发现Wnt/β-catenin在骨正常生长和代谢中极为重要,β-catenin是介导成骨细胞存活和分化的关键分子。罗莫珠单抗、狄诺塞麦等新研发药物通过调节Wnt/β-catenin信号通路,进而影响骨髓间充质干细胞的成骨作用、成骨细胞的增殖和分化以及破骨细胞的生成等,参与骨质疏松的调节。本文就β-catenin在成骨细胞、破骨细胞功能调控和骨质疏松中的具体作用进行总结,进一步探讨Wnt蛋白和β-catenin的研究进展,以发掘更多创新的靶点来解决骨质疏松症的治疗问题。
徐鹏[2]（2021）在《隔药饼灸治疗内异症miRNAs及PI3K-Akt信号通路的理论和实验研究》文中提出目的:1、通过文献研究法,梳理古今医家和现代医学对内异症的研究,探究灸法治疗内异症的原理及作用规律。2、通过改良的自体移植法诱导建立内异症小鼠模型,在验证隔药饼灸对内异症痛经具有良好的镇痛作用、抑制异位内膜体积生长的基础上,探究隔药饼灸对内异症小鼠miRNA表达的影响,并进行PCR验证,检测其对PI3K/Akt信号通路表达的影响。3、综合文献和实验研究,通过对经络、腧穴、筋膜、miRNA、信号通路关系的研究,探讨隔药饼灸抗细胞粘附侵袭、抗细胞生长增殖和抗血管生成作用的经络机理,研究关元穴隔药饼灸治疗内异症具体的机制。方法:44只SCID实验小鼠,五只一笼,采用改良自体移植法,将一侧子宫裁剪成大小为5×5mm的片段,把子宫内侧面固定在另一侧的腹壁上,术后断食一天并连续肌注青霉素三天防止感染,七天后随机选取两只,开腹显示病灶处异位内膜体积增大,为直径5～8mm的半透明囊泡,内有液体积聚,有新生血管,表明造模成功。将造模成功的小鼠不区分体重大小等因素,随机分为模型组（A组）、西药组（B组）、隔药饼灸组（C组）,每组12只,按每笼4只饲养。各组自造模结束后第14天起给药,每天一次,连续两周。模型组用8号灌胃针进行等体积生理盐水灌胃。隔药饼灸组用附子、红花、当归等中药按比例打粉并与黄酒混合,用自制模具制作规格为10mm×10mm×4.5mm的药饼,用模具制作的艾炷于关元穴进行隔药饼灸,每只小鼠灸4壮。西药组用达那唑溶液按36mg/kg体质量进行灌胃。治疗期间记录隔药饼灸镇痛效果,治疗结束后测量各组异位内膜组织大小,提取各组小鼠的异位内膜组织并用保存并进行相关检测。高通量测序方法筛选EMs实验各组的异位内膜差异表达miRNAs,预测miRNA的下游靶基因,通过MAGIA2软件和Pearson相关系数将靶基因与miRNAs进行配对,采用qRT-PCR的方法对以上确定出的关键miRNAs和靶基因进行验证;对调控网络中基因差异表达进行分析,使用DAVID软件对筛选的miRNA进行功能分析,并应用超几何检验获得显着富集的GO条目和KEGG路径图谱;利用western blotting技术检测PI3K-Akt-mTOR信号通路及相关因子的表达。结果:1、隔药饼灸组发生扭体反应总次数呈下降趋势,有扭体反应的小鼠数量、扭体次数和扭体发生率均在降低,且数据具有统计学意义,表明隔药饼灸对小鼠痛经的镇痛效果明显。2、隔药饼灸组的平均生长抑制率为86.28%,优于西药组的78.65%,隔药饼灸的对异位内膜的生长抑制作用效果更明显。3、差异化表达的miRNA与模型组相比,隔药饼灸组筛选出4个下调miRNA:miR-6538,miR-3470a,miR-2137,miR-5126。与西药组相比,隔药饼灸组筛选出9个下调miRNA:miR-499-5p,miR-133b-3p,miR-496a-3p,miR-206-3p,miR-21a-5p,miR-3473b,miR-493-5p,miR-133a-3p,miR-487b-3p。筛选出4个上调miRNA:miR-183-5p,miR-205-5p,miR-181a-2-3p,miR-200c-3p。与模型组相比,西药组筛选出10个下调miRNA:miR-21a-5p,miR-3473b,miR-483-3p,miR-6240,miR-3963,miR-3970,miR-15a-5p,let-7i-5p,miR-2137,miR-5126。筛选出7个上调miRNA:miR-195a-3p,miR-615-3p,miR-708-3p,miR-296-3p,miR-671-3p,miR-298-5p,miR-181a-2-3p。4、PCR验证miRNA通过各组共同调控的miRNA,筛选出miR-2137、miR-5126、miR-3963、miR-6240、miR-1981-5p、miR-708-3p、miR-3473b、miR-206-3p、miR-21a-5p、miR-181a-2-3p这十个miRNA,经过实时荧光定量检测,筛选出miR-708-3P、miR-5126-3P、miR-1981-5P、miR-206-3p这4个miRNA,最终确定miR-708-3P、miR-5126-3P这两个miRNA符合条件。5、PCR验证mRNA对PCR筛选出的miR-708-3P、miR-5126-3P各自调控的mRNA有Igf1r、Mapk1、VEGF、Ppp2r5c、Magi2、Wnt7a、Nprl3、Rps6ka2、Igf1、Sos1进行实时荧光定量检测,结合miRNA与mRNA的负调控关系,筛选出Vegf、Ppp2r5c、Wnt7a、Rps6ka2这四个靶基因。6、Western Blot检测PI3K-Akt-mTOR蛋白WB检测各组相应的PI3K、Akt、mTOR三种蛋白的表达含量,与模型组相比,隔药饼灸组的三种蛋白表达含量均下降且具有统计学意义,而西药组虽然三种蛋白表达含量亦下降,但PI3K蛋白的降低量未达统计学意义,Akt、mTOR的下降具有统计学意义。结论:1、隔药饼灸对内异症小鼠具有显着的镇痛作用和抑制异位内膜组织生长得作用。2、隔药饼灸可以调控内异症小鼠的miRNA和相应的靶基因,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而抗细胞粘附侵袭、抗细胞生长增殖和抗血管生成,对异位内膜组织起到治疗作用。3、对关元穴隔药饼灸可以调控筋膜上的miRNA、靶基因PI3K/Akt/mTOR信号通路,调整三焦焦膜的理化特性,进而调整冲任二脉的经气,治疗子宫内膜异位症。
罗枭磊[3]（2021）在《UBD在哈、维、汉三民族食管鳞癌组织中的表达及临床病理学意义》文中认为目的:探讨泛素样蛋白D（Ubiquitin D,UBD）在哈萨克、维吾尔和汉族三民族食管鳞癌患者癌及癌旁正常粘膜组织中蛋白和m RNA水平的表达情况,并探究其临床病理学意义。方法:收集173例食管鳞癌患者癌和癌旁正常粘膜组织标本,其中包含维吾尔、哈萨克和汉族。采用免疫组织化学染色法和实时荧光定量PCR法检测UBD的表达水平,并结合患者临床病理特征及预后资料探究UBD与患者临床恶性表型和预后的相关性,揭示UBD在食管癌中的表达情况、临床意义、预后关系以及预测其在食管癌发生、发展中可能发挥的功能。结果:三民族食管鳞癌组织中UBD在蛋白和m RNA水平的表达均高于癌旁正常粘膜组织（P<0.05）。不同民族食管鳞癌组织中,UBD在蛋白和m RNA水平表达量相仿,差异无统计学意义（P>0.05）。食管鳞癌组织中UBD表达与肿瘤神经脉管侵犯、淋巴结转移和分化程度等有关,高UBD表达患者表现出更高的肿瘤神经脉管侵犯、淋巴结转移可能性。在中-低分化程度肿瘤中,对比高分化肿瘤UBD具有较高的表达率。UBD高表达患者总体生存率下降,与患者年龄、淋巴结转移、肿瘤分化程度、神经脉管侵犯、肿瘤TNM分期和UBD表达相关,差异具有统计学意义（P<0.05）多因素Cox回归分析发现年龄、神经脉管侵犯,肿瘤TNM分期是影响食管癌患者预后的独立危险因素（P<0.05）。结论:（1）UBD m RNA在三名族食管鳞癌组织中相对于癌旁正常组织显着高表达,三名族间表达量相仿,无统计学差异;（2）UBD蛋白在食管鳞癌组织中高表达,三名族间的表达情况相仿,不具有统计学差异。且与患者肿瘤TNM分期、淋巴结转移、分化程度等临床恶性表型显着相关,可能起着促癌基因的功能;（3）UBD高表达患者表现出预后更差的趋势;年龄、神经脉管侵犯,肿瘤TNM分期是食管鳞癌患者预后的独立危险因素;
叶琛[4]（2020）在《NeuroD1调控CA3介导脊索瘤细胞增殖侵袭的机制研究》文中指出研究目的:脊索瘤是一种起源于胚胎残余脊索的恶性骨源性肿瘤,据国外数据统计其发病率占原发性恶性骨肿瘤的1%-4%;而本课题组统计的华东区地区骨肿瘤发病数据显示其占比高达9.8%,是最常见的恶性骨源性肿瘤。脊索瘤对化疗不敏感,对放疗部分敏感,目前手术切除是治疗脊索瘤的主要手段。尽管脊索瘤恶性程度较低,但“手术-复发”的循环在患者生存期内几乎无法避免,由于术后解剖结构的紊乱,以及毗邻重要神经血管,每次复发都会加大手术难度,肿瘤最终无法得到有效控制,导致患者死亡。因此,研究脊索瘤恶性生物学行为的分子机制,是探索脊索瘤新的治疗策略及靶向药物的关键。我们通过转录组测序发现碳酸酐酶3（CA3）和NeuroD1在脊索瘤组织中的表达显着高于正常脊索组织。CA3是碳酸酐酶基因家族中的一员,在体内主要参与氧化代谢和离子交换有关的关键生理过程;Neuro1是一种胚胎发育过程中高表达的转录因子。两者在脊索瘤中尚无报道,本课题拟阐明Neuro1对CA3是否具有转录调控关系及其对脊索瘤恶性生物学的作用。实验方法:1、通过蛋白免疫印迹实验、病理学标本处理以及组织芯片高通量免疫组化染色,验证CA3和NeuroD1在脊索瘤组织中和细胞中的表达情况以及共表达关系。2、通过信息学挖掘、基因片段PCR合成、琼脂糖凝胶的电泳与回收、质粒克隆重组等分子生物学技术构建目标基因的过表达载体及荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告实验检测NeuroD1是否对CA3具有转录激活作用。3、构建NeuroD1和CA3的敲减与过表达脊索瘤细胞系,通过WB实验检测表达或敲减效率,CCK8和Transwell实验检测干预CA3或NeuroD1表达后脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力。将CA3敲减脊索瘤细胞进行转录组测序和分析,挖掘存在关联的肿瘤相关基因和信号通路。实验结果:1、选取5名脊索瘤患者的肿瘤组织标本和正常椎间盘组织作为对照进行蛋白质免疫印迹实验,发现CA3和NeuroD1在脊索瘤组织中的表达量高于正常组织。在后续的组织芯片免疫组织化学染色中再次确认了CA3和NeuroD1在脊索瘤细胞中异常表达升高。初步证明了两者在脊索瘤组织中高表达且存在共表达关系。2、通过生物信息学预测了NeuroD1在CA3启动子区域的结合位点,以此设计出共价结合的目标片段,构建了两者的过表达荧光素酶报告基因载体,并通过双荧光素报告基因验证证明了NeuroD1与CA3基因具有靶向调节关系。3、通过CCK8增殖和Transwell实验证实过表达CA3可以显着促进脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力;相反,敲减CA3的表达可以显着抑制脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力。同时,敲减NeuroD1的可以导致CA3表达量的减低,进一步证实NeuroD1对CA3存在调控作用。通过敲减CA3的脊索瘤细胞的转录组测序分析,发现了171个差异表达基因和6条存在明显富集的信号通路。实验结论:1、发现NeuroD1和CA3在脊索瘤组织中相比正常组织表达量升高,且存在共表达关系;2、构建了CA3和NeuroD1的过表达载体,从分子和蛋白功能层面首次证明了NeuroD1对CA3基因存在转录激活作用;3、CA3基因对脊索瘤细胞的增殖与侵袭起促进作用,在脊索瘤的促癌基因。CA3基因功能受抑制后,有171个基因出现显着的表达改变,并富集于6条信号通路中,其中的调控机制仍需进一步研究。
姜全伟[5]（2020）在《miR-203a通过靶向Slug调控EMT抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的机制研究》文中研究说明背景肺癌是一种常见的肺部原发性恶性肿瘤,已成为威胁人类健康的重大原因,微小RNA（micro RNA,miRNA）通过与靶基因m RNA 3’非编码区域（Untranslated Regions,UTR）互补配在转录后水平负向调控m RNA的表达,与包括肺癌在内的多种疾病的发生发展关系密切。因miR-203基因具有来源于上皮基底细胞的特性,使其与恶性肿瘤的相关性研究成为焦点。miR-203a属于miR-203家族成员,被证实在肺癌组织和细胞中异常低表达,但其调控肿瘤细胞转移的作用及其分子机制尚不完全明确。目的探讨miR-203a对非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响及其机制,以期为肺癌靶基因治疗提供新的线索和依据。方法将体外培养的A549细胞分为对照组（未转染）、miR-NC组（转染miR-203a mimics对照）、miR-203a组（转染miR-203a mimics）、anti-miR-NC组（转染miR-203a inhibitor对照）和anti-miR-203a组（转染miR-203a inhibitor）,采用RT-PCR检测各组细胞中miR-203a的表达水平,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达。运用生物信息学软件预测miR-203a的潜在靶基因,并采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-203a与Slug的靶向关系,Western blot和RT-PCR检测miR-203a对Slug表达的调控作用;脂质体法转染pc DNA3.1-Slug过表达质粒和干扰序列si Slug及其相应对照pc DNA3.1和si NC,分别采用划痕实验、Transwell小室实验和Western blot检测Slug对miR-203a调控下A549细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）相关蛋白Slug、E-cadherin、Vimentin表达的影响。结果1、与对照组相比,miR-203a组中迁移距离明显降低（P<0.05）,侵袭细胞数明显降低（P<0.05）,而anti-miR-203a组较对照组明显升高（P<0.05）。2、与对照组相比,miR-203a组细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显升高,而Vimentin蛋白的表达水平均明显降低（P<0.05）;与对照组相比,anti-miR-203a组中E-cadherin蛋白的表达水平明显降低,而Vimentin蛋白的表达水平均明显升高（P<0.05）。3、生物信息学软件预测到Slug 3’UTR存在能够与miR-203a互补的结合位点,双荧光素酶报告基因证实Slug是miR-203a的潜在靶基因。4、与对照组相比,miR-203a组细胞中Slug蛋白和m RNA的表达明显降低（P<0.05）,而anti-miR-203a组细胞中Slug蛋白和m RNA的表达明显升高（P<0.05）。5、与对照组相比,miR-203a组中迁移距离、侵袭细胞数以及Slug、Vimentin蛋白表达均明显降低,而E-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.05）;与miR-203a组相比,miR-203a+pc DNA组无明显变化（P>0.05）,但是miR-203a+Slug组中迁移距离、侵袭细胞数以及Slug、Vimentin蛋白表达明显升高,而E-cadherin蛋白表达明显降低（P<0.05）。6、与对照组相比,anti-miR-203a组中迁移距离、侵袭细胞数以及Slug、Vimentin蛋白表达均明显升高,而E-cadherin蛋白表达明显降低（P<0.05）;anti-miR-NC组和对照组之间无显着性差异（P>0.05）;与anti-miR-203a组相比,anti-miR-203a+si NC组无明显变化（P>0.05）,但是anti-miR-203a+si Slug组中迁移距离、侵袭细胞数以及Slug、Vimentin蛋白表达明显降低,而E-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.05）。结论1、miR-203a可抑制A549细胞迁移和侵袭。2、miR-203a抑制A549细胞迁移和侵袭的机制可能与抑制EMT进程有关。3、Slug是miR-203a的潜在靶基因。4、miR-203a可通过靶向Slug调控EMT抑制肺癌A549细胞迁移和侵袭。
唐亮[6]（2020）在《C5a/C5aRs通过ERK信号通路调控OPN及PD-L1促进乳腺癌发生骨转移的机制研究》文中研究指明研究背景乳腺癌具有较高的发病率与死亡率,我国每年新增乳腺癌病例约30万,其中近30%的患者因此死亡,因此,在威胁女性健康的肿瘤中乳腺癌居于首位。乳腺癌还具有较高的转移发生率,其中骨组织是较为常见的转移部位。处于乳腺癌早期的患者,其骨转移发生率约为25%,而处于中后期的乳腺癌患者骨转移发生率高达80%,并且一旦发生骨转移,近80%的患者无法达到5年生存期。同时,骨转移也导致了严重的骨相关不良事件,使患者的生活质量受到极大的影响。因此,寻找乳腺癌发生骨转移的治疗靶点迫在眉睫。根据乳腺癌分子分型进行归类发现,不同类型的乳腺癌细胞,具有不同的器官转移倾向性,其中三阴性乳腺癌较容易发生脑转移及肺转移,而导管型的乳腺癌发生骨转移比率较高。根据以上特性,本研究通过分析TCGA数据库中乳腺癌的临床数据,发现在导管型乳腺癌中,补体激活产物C5a及其受体C5aR2的表达量较其他类型显着升高。而补体系统既参与了肿瘤相关的免疫反应,又是肿瘤微环境的重要组成部分。当机体出现肿瘤后,炎症反应也随之而来,其中固有免疫系统首先被激活,作为固有免疫系统的重要部分,补体系统的活化更是首当其冲。在补体活化过程中,会产生大量的补体激活产物,其中的过敏毒素可扩散至机体各个部位而发挥作用,而过敏毒素中C5a的强度和影响力居于首位。因此,补体激活产物C5a及其受体在乳腺癌发生骨转移中的调控作用与机制,是本研究重点关注的内容。研究目的1、明确补体激活产物C5a/C5aRs与乳腺癌发生骨转移的相关性;2、探究C5a/C5aRs在调控乳腺癌发生骨转移相关微环境中的作用;3、探索C5a/C5aRs调控乳腺癌发生骨转移的分子机制。研究方法1、首先,利用TCGA数据库,对于乳腺癌相关的临床数据进行分析,重点关注了导管型乳腺癌基因的表达情况。进一步通过生物信息学的方法分析了,补体激活产物C5a及其受体与乳腺癌发生骨转移的相关性。随后,利用具有骨转移倾向的乳腺癌细胞系与乳腺癌骨转移病灶的标本,通过Q-PCR的方法检测了,补体激活产物C5a及其受体的基因表达量。随后,本研究通过免疫组织化学（IHC）和酶联免疫吸附实验（ELISA）的方法,明确了C5a及其受体在蛋白水平的表达量。最后,通过动物实验,观察了C5a/C5aRs通路与乳腺癌发生骨转移的相关性,利用sh RAN干扰的方法分别敲减了乳腺癌细胞系BT474的C5aR1、C5aR2,并通过左心室注射乳腺癌细胞的方法构,构建了乳腺癌发生骨转移的动物模型,并观察了动物骨转移发生的情况,以及骨免疫微环境的变化情况。2、通过构建乳腺癌转移前微环境的动物模型,观察了C5a/C5aRs通路在乳腺癌发生骨转移前微环境中的作用。主要观察了C5a/C5aRs通路在乳腺癌细胞迁移以及增殖中的作用。随后,通过成骨细胞分化、破骨细胞分化以及破骨细胞前体细胞的招募实验,明确了C5a/C5aRs通路在调控骨微环境中的作用。本课题亦利用了流式细胞术,检测了C5a/C5aRs通路在调控免疫微环境中的作用。3、在机制研究方面,首先,通过破骨细胞分化实验,发现补体激活产物C5a诱导乳腺癌细胞的条件培养基,在不同C5a受体的表达水平下,其促进破骨细胞分化的功能也随之改变。随后,通过蛋白芯片筛查的方法,富集到影响较为明显的信号通路,并通过加入相关信号通路抑制剂的方法,验证了蛋白芯片的结果。亦通过免疫印迹试验（Western Blot）对ERK信号通路磷酸化进行证实。从蛋白芯片分析的结果中,分别筛选出与骨微环境和免疫微环境相关的差异蛋白,OPN与PD-L1。在验证蛋白芯片结果的实验中,通过Q-PCR的方法进行了OPN与PD-L1基因表达的检测。本研究进一步通过OPN与PD-L1中和抗体的使用,在蛋白质水平进行了验证。研究结果1、通过分析TCGA数据库发现,在导管型的乳腺癌中C5a/C5aR2呈现高表达的状态,并且通过生物信息学分析表明,C5a/C5aRs高表达的乳腺癌患者,更容易发生骨转移,而且相对于原发灶,在乳腺癌发生骨转移的病灶中,C5aRs亦呈现高表达的状态。在具有骨转移倾向的乳腺癌细胞系以及乳腺癌骨转移灶的标本中,也检测到C5a/C5aRs表达水平较高。在临床病例中还发现,乳腺癌发生骨转移患者的血清中,补体激活产物C5a的含量较原位癌患者升高,通过免疫组织化学的方法发现,在乳腺癌发生骨转移的病灶中,C5aR1、C5aR2的表达量和原发灶相比,呈现高表达的状态。在动物实验中,分别敲减了C5aR1、C5aR2的乳腺癌细胞,其骨转移发生率下降,并且骨髓免疫微环境中的MDSCs数量减少。2、本研究通过直接加入补体激活产物C5a,以及加入C5a诱导乳腺癌细胞后收集的条件培养基,分别对于C5a/C5aRs通路,调控乳腺癌骨转移相关微环境进行了研究,结果表明C5a/C5aRs通路可以促进乳腺癌细胞的迁移和增殖,并且在调控骨微环境方面还发现,C5a/C5aRs通路可促进破骨细胞前体细胞的招募以及促进成骨、破骨细胞的分化,并且在免疫微环境中,C5a/C5aRs通路还具有抑制CD4+T淋巴细胞增殖以及招募MDSCs的功能。3、C5a诱导敲除C5aR1、C5aR2的乳腺癌细胞后,相较于对照组,其条件培养基促进破骨细胞分化的功能减弱。通过蛋白芯片分析条件培养基,并在KEGG富集后,发现影响较为明显的信号通路为PI3K-AKT以及MAPK信号通路。通过加入上述信号通路的相关蛋白抑制剂后发现,C5a诱导的乳腺癌细胞所收集的条件培养基中,加入ERK抑制剂组,较明显地抑制了条件培养基促进破骨细胞分化的功能。在免疫印迹实验中同样发现,C5a可以调控乳腺癌细胞ERK蛋白的磷酸化。分析条件培养基中的差异蛋白发现,在骨微环境以及免疫微环境中,表达差异较为显着的蛋白分别为OPN和PD-L1,并在加入C5a诱导后,OPN与PD-L1在m RNA水平表达量呈浓度依赖性升高,而在分别敲减乳腺癌细胞C5aR1、C5aR2以及加入ERK抑制剂后,OPN与PD-L1在m RNA水平表达量均下调。本研究通过加入OPN中和抗体后发现,C5a诱导乳腺癌细胞后所收集的条件培养基,促进成骨细胞分化的功能减弱,还发现加入PD-L1中和抗体后,条件培养基抑制CD4+T淋巴细胞增殖的功能亦减弱,并且联合使用两种中和抗体后发现,抑制条件培养基招募MDSCs的功能较单独加入,得到了进一步的抑制作用。研究结论通过本研究表明,补体激活产物C5a及其受体C5aRs,与乳腺癌发生骨转移存在着密切的关系。在乳腺癌发生骨转移的过程中,C5a/C5aRs参与调节了乳腺癌骨转移相关微环境的形成,促进骨微环境中成骨细胞和破骨细胞的分化,同时也促进了肿瘤细胞的迁移和增殖,在骨髓免疫微环境中,C5a/C5aRs通路还发挥了免疫抑制的作用。相关机制研究表明,C5a与C5aRs结合后通过ERK信号通路调控PD-L1和OPN的表达,在乳腺癌发生骨转移过程中发挥了相应的作用。
李阳[7]（2020）在《TRB3表达水平通过Wnt/β-catenin信号通路对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的影响机制》文中进行了进一步梳理目的:探讨Tribbles同源物3（TRB3）在不同的表达水平时对博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化的影响机制。探讨外源性调控TRB3在Wnt/β-catenin信号通路中对博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化的影响机制。方法:将60只C57小黑鼠随机分为5组,分别为单纯生理盐水组（Mock组）、单纯纤维化组（F组）、纤维化+空载腺病毒组（F+GFP组）、纤维化+TRB3过表达组（F+TRB3组）、纤维化+TRB3低表达组（F+sh-TRB3组）,每组12只。将博莱霉素溶液缓慢滴入小鼠气管,构建肺纤维化模型;造模第2日,通过尾静脉为小鼠注射相应的腺病毒,单纯生理盐水组及单纯纤维化组注入等量的生理盐水。分别于造模后第7天、第14天、和第28天三个时间点将C57小鼠分批处死,收集实验用小鼠肺泡灌洗液和肺组织制作相应标本。进行实验小鼠不同时间点肺部炎症变化及纤维化程度判断:通过HE染色和Masson染色观察肺组织形态学变化并进行纤维化评分,羟脯氨酸测定明确胶原蛋白含量,对肺泡灌洗液进行染色观察;免疫组化检测小鼠肺组织TRB3、上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、α-SMA和β-catenin蛋白的表达情况;用Westernblot的方法检测TRB3、上述EMT相关蛋白及β-catenin蛋白在各组肺组织中的表达;用RT-qPCR的方法从mRNA水平检测肺组织中TRB3、proCollaⅠ/Ⅲ的表达;ELISA检测各组肺组织Col1aⅠ/Ⅲ的含量。结果:成功构建了博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。HE染色和Masson染色、纤维化评分、羟脯氨酸测定、BALF染色显示TRB3高水平表达使博莱霉素诱导的C57实验小鼠肺组织在相应时间点炎症表现及纤维化表现更为明显,TRB3低水平表达组结果相反。免疫组化结果显示:在TRB3过表达组中β-catenin蛋白和EMT相关蛋白vimentin、α-SMA、Fibronectin的阳性表达显着高于单纯纤维化组,而蛋白E-cadherin的阳性表达则相反。Westernblot检测显示:TRB3过表达使肺纤维化小鼠EMT相关蛋白Vimentin、Fibronectin、α-SMA及β-catenin蛋白表达增加、E-Cadherin表达减少,而TRB3表达下调组则结果相反。RT-qPCR检测提示在mRNA水平,TRB3过表达组proCollaⅠ/Ⅲ表达上调,TRB3低表达组则结果相反。ELISA检测显示:TRB3过表达使各组肺组织Col1aⅠ/Ⅲ的含量明显升高,TRB3表达下调组则结果相反。结论:TRB3表达变化可以影响EMT相关蛋白和胶原蛋白mRNA的表达,提示外源性调控TRB3的表达可能对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的EMT过程有影响,进而参与肺纤维化的形成。TRB3过表达使Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin蛋白表达增加,提示TRB3可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的过程。
张耀文[8]（2020）在《食管鳞状细胞癌hsacircRNA6448-14的功能及机制的初步研究》文中研究说明研究背景环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新型的非编码RNA,在恶性肿瘤的进展中发挥重要作用。然而,circRNA在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的作用尚不清楚,因此我们构建我国高发区ESCC的circRNA表达谱,并探讨关键circRNA在ESCC中的功能及机制。第一部分 食管鳞状细胞癌相关circRNA表达谱分析目的构建我国高发区ESCC相关circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA并对其进行功能预测。方法选取6对ESCC组织和配对癌旁正常组织样本,采取基因芯片技术和微阵列分析构建circRNA表达谱;以差异倍数（FC）≥ 2倍且p<0.05为条件,筛选差异表达的circRNA;通过GO和Pathway分析,预测circRNA的功能;构建circRNA-miRNA调控网络图,探讨circRNA作用机制。结果CircRNA在ESCC组织与匹配癌旁正常组织的表达差异明显,共发现15908个circRNAs表达失调（FC≥2.0,p值<0.05）,其中上调7161个,下调8747个。差异表达的circRNAs大多数分布在chr1、chr2、chr3和chr5,以1号染色体上最多。大多数差异表达的circRNAs是外显子来源,占比84.02%。GO和Pathway分析结果显示,差异表达的circRNAs主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节、结合、催化活性等生物学功能,参与细胞外基质受体相互作用、粘着斑、蛋白质消化与吸收等多个调控通路。挑选FC最大的8个差异表达的circRNAs,共有 222 种 miRNAs 结合到这 8 种 circRNAs 上,构建 circRNA-miRNA网络调控图,能够更好地理解circRNA的相关机制,为探讨circRNA在ESCC中的生物学功能提供思路。结论成功构建ESCC相关circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA,绘制circRNA-miRNA网络调控图进行功能预测,揭示差异表达circRNA与ESCC存在密切联系。第二部分 HsacircRNA6448-14在食管鳞状细胞癌的诊断及临床意义目的验证初筛差异表达circRNA,找出关键circRNA,研究其在ESCC中的诊断价值及其临床意义。方法根据FC值、p值和信号值从差异表达circRNAs中随机选取7种circRNAs,筛选出5种差异表达circRNAs,进行qRT-PCR验证。qRT-PCR验证分两步进行:第一步,在26对ESCC组织及配对癌旁正常组织样本中对5种差异表达circRNAs进行验证,找出关键circRNA;第二步,另选取50对样本验证关键circRNA的表达差异。随访并记录ESCC患者术后的总生存期（Overall Survival,OS）和无病生存期（Disease-free Survival,DFS）;使用卡方检验或确切概率法（Fisher检验）分析关键circRNA表达与ESCC临床病理特征的关系;生存预后采用Kaplan-Meier法并Log-rank检验行单因素分析,Cox回归模型行多因素分析;以p<0.05为差异具有统计学意义。结果通过qRT-PCR验证26对ESCC组织及癌旁正常组织样本,找到关键circRNA hsa-circRNA6448-14,发现 hsa-circRNA6448-14 在 ESCC 组织中显着上调（p=0.0027）。然后在50对食管鳞癌患者样本中进行qRT-PCR验证,发现hsacircRNA6448-14在ESCC组织中较癌旁正常组织表达显着上调（p=0.003）,与芯片分析和第一步验证结果一致;ROC曲线下面积为0.906（95%CI:0.899～0.903,p=0.021）,敏感度和特异度分别为 82.9%和 85.5%。HsacircRNA6448-14 表达与分化和 pTNM 分期（p=0.003、p=0.036）呈正相关。单因素及Cox多因素分析结果显示,pT分期和hsacircRNA6448-14表达为ESCC术后DFS的独立预后因素（p=0.031、p=0.014）,HR值分别为1.755（95%CI=1.054～2.921）、0.376（95%CI=0.173～0.819）;食管癌家族史、pT分期和hsacircRNA6448-14表达为ESCC术后OS的独立预后因素（p=0.033、p=0.007、p=0.003）,HR 值分别为 2.149（95%CI=1.062～4.347）、2.516（95%CI=1.280～4.947）、0.199（95%CI=0.069～0.573）。HsacircRNA6448-14 高表达患者的 DFS 和 OS 较差,提示 hsacircRNA6448-14高表达与ESCC的不良预后有关。结论HsacircRNA6448-14对ESCC的诊断和预后评估具有一定的临床价值,可作为ESCC潜在的生物学标志物。第三部分 HsacircRNA6448-14对食管鳞状细胞癌生物学行为的影响目的探讨hsacircRNA6448-14对ESCC生物学行为的影响,深入了解hsacircRNA6448-14 与 ESCC 的关系。方法建立hsacircRNA6448-14敲低及过表达ESCC细胞模型,通过CCK-8实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,划痕实验检测细胞迁移,Transwell检测细胞迁移及侵袭,明确hsacircRNA6448-14在ESCC中的生物学功能。结果HsacircRNA6448-14在4种ESCC细胞株中的表达显着高于食管正常上皮细胞（p<0.05）,hsacircRNA6448-14 在 KYSE150 中表达水平最高,在 TE7中表达水平最低,因此选择这两种细胞株分别进行hsacircRNAA6448-14敲低实验和过表达实验。敲低hsacircRNA6448-14后KYSE150细胞增殖率降低,并且随着时间的延伸,尤以48h和72h最为显着;而过表达hsacircRNA6448-14能显着增强TE7细胞的增殖能力（两者均p<0.01）。敲低hsacircRNA6448-14可以显着提高KYSE150细胞凋亡率,降低细胞迁移及侵袭能力;而过表达hsacircRNA6448-14则明显降低TE7细胞凋亡率,提高细胞迁移及侵袭能力（均p<0.01）。结论HsacircRNA6448-14能促进ESCC细胞增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,在ESCC的发生发展中发挥促癌的正性调控作用。第四部分 HsacircRNA6448-14负性调控miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中作用机制的初步研究目的探讨ESCC中hsacircRNA6448-14对下游miRNA的作用机制。方法通过生物信息学方法预测hsacircRNA6448-14的下游miRNA及其mRNA,绘制circRNA-miRNA-mRNA网络图,并行GO及Pathway富集分析。RNA pull down实验验证hsacircRNA6448-14与miRNA的靶向结合位点。qRT-PCR检测ESCC组织中miR-455-3p的表达水平,并分析其与hsacircRNA6448-14表达的相关性。结果预测hsacircRNA6448-14可能的miRNA结合位点,依次为miR-503-5p、miR-455-3p、miR-4646-5p、miR-382-5p 和 miR-204-5p,绘 制hsacircRNA6448-14-miRNA-mRNA 网络调控图。GO 及 Pathway 分析显示,hsacircRNA6448-14可能参与细胞发生、发展、信号传导等生物学过程,参与结合,核结合转录因子的活性等分子功能,参与轴突导向、催化活性、粘着斑和肿瘤蛋白聚糖等通路的调控。RNA pull down实验表明hsacircRNA6448-14可以与miR-455-3p靶向结合。MiR-455-3p在ESCC组织中表达水平低于匹配的癌旁正常组织,呈显着表达下调（p<0.001）,且hsacircRNA6448-14表达和miR-455-3p 表达呈负相关（r=-0.701,p<0.001）。结论HsacircRNA6448-14可以靶向结合miR-455-3p,可能通过负性调控miR-455-3p及其相关通路参与ESCC的发生发展。
高涵[9]（2020）在《Hsa＿circ＿0001707在食管癌发生发展中的功能及其分子海绵机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:食管癌（Esophageal cancer,EC）是一种高发病率和病死率的疾病,位居全球癌症死因的第六位,预后较差,严重危害人类的健康。食管癌系指食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶性肿瘤,包括食管腺癌和食管鳞状细胞癌两种临床亚型。中国是食管鳞状细胞癌的高发地区,每年新发病例数约占全球总发病数的50%以上。食管鳞癌早期临床症状不明显,较难发现,且目前缺乏有效的癌前病变筛查诊断标志物,五年内的整体生存率仅有15%。因此,探索潜在的表观遗传标志物,不但可以促进食管鳞癌的早期识别和干预,降低癌变率;而且有助于临床靶向治疗的发展,改善患者整体预后情况。环状RNA（circularRNAs,circRNAs）是一类新型的非编码RNA分子,具有共价闭合结构,不易被核酸外切酶所降解,表现为高度稳定性,保守性和特异性。近年来,大量证据表明环状RNA能够在基因调控过程中发挥关键作用,参与介导多种疾病的发生发展。此外,随着研究的不断深入,报道发现环状RNA可能与肿瘤异常增殖,分化和转移等生物学过程密切相关,扮演着类癌基因或抑癌基因的角色。因此,环状RNA作为一种新型生物标志物,可能在食管鳞癌的恶性表型变化,分子机制和诊疗方面中发挥重要的作用。课题组前期采用二代高通量测序技术,筛选出在食管鳞癌患者癌组织中表达上调的环状RNA,hsa＿circ＿0001707。为此,本研究的主要目的是探讨hsa＿circ＿0001707在食管鳞癌中发挥的生物学功能及其参与调控的分子机制。验证hsa＿circ＿0001707在人群组织样本中的差异表达情况,探讨其表达水平与食管鳞癌发病风险之间的相关性,有望为食管鳞癌早期筛查诊断,患者预后评估和临床治疗新靶点的发现提供理论依据。研究方法:一、qRT-PCR检测hsa＿circ＿0001707在食管鳞癌组织样本中的表达,分析其表达水平在癌组织及癌旁组织中的差异;条件logistic回归分析探讨hsa＿circ＿0001707的表达水平与食管鳞癌发病风险之间的相关性;通过绘制ROC曲线,评估hsa＿circ＿0001707作为生物标志物的诊断价值。分别应用Rnase R,放线菌素D抑制试验,普通琼脂糖凝胶电泳试验检测hsa＿circ＿0001707的一般环状特性及稳定性,并比较其与亲本基因之间的区别;二、检测hsa＿circ＿0001707对食管鳞癌细胞发挥的生物学功能:构建慢病毒载体,分别转染至食管鳞癌细胞株EC109及EC9706中,获得hsa＿circ＿0001707稳定过表达和干扰细胞株,qRT-PCR检测转染效率;应用CCK-8,Ed U,平板克隆试验,transwell体外迁移和侵袭试验检测hsa＿circ＿0001707对细胞活性,增殖能力,克隆形成能力以及侵袭迁移能力的影响。三、分析hsa＿circ＿0001707的亚细胞定位:应用荧光原位杂交技术（FISH）和细胞核质分离试验检测hsa＿circ＿0001707在食管鳞癌细胞中的定位;通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0001707可能结合的靶miRNAs,并应用双荧光素酶报告基因试验（DLR）进一步筛选,确定候选靶miRNA;四、检测hsa＿circ＿0001707与靶miRNA的相互调控关系:干扰hsa＿circ＿0001707的表达水平后,qRT-PCR检测miR-203a-3p的表达情况,DLR试验确定两者之间的相互调控关系。设计挽救试验,在hsa＿circ＿0001707稳定干扰细胞株中转染miR-203a-3p inhibitor,通过CCK-8,平板克隆试验,transwell侵袭迁移试验进一步验证两者之间的调控关系。五、应用DLR试验,qRT-PCR结合western Blot技术确定hsa＿circ＿0001707以“分子海绵”的形式间接调控靶miR-203a-3p下游的靶基因及其信号转导通路。研究结果:一、Hsa＿circ＿0001707在食管鳞癌组织中的表达及其一般特性验证1.本研究收集了96对食管鳞状细胞癌患者的癌组织及其配对癌旁组织,应用qRT-PCR检测hsa＿circ＿0001707在组织中的表达水平。结果显示,与正常癌旁组织相比,hsa＿circ＿0001707在癌组织中表达量显着升高,差异有统计学意义（p<0.001）。2.条件logistic分析结果显示,在癌组织中表达上调的hsa＿circ＿0001707可增加食管鳞癌的发病风险,OR值为2.323,是食管鳞癌发生的危险因素。通过绘制ROC曲线,结果发现,hsa＿circ＿0001707具有较高的诊断价值,AUC为0.793（95%CI:0.730～0.855）,灵敏度为0.735,特异度为0.724,差异有统计学意义（p<0.001）。3.Rnase R试验及放线菌素D抑制试验结果显示,与亲本基因ABCA13相比,hsa＿circ＿0001707具有更高的稳定性;4.普通琼脂糖凝胶电泳结合sanger测序的结果表明,hsa＿circ＿0001707并非基因错误剪辑的产物,而是由其母基因的内含子反向剪接形成,属于内含子型circRNA。二、Hsa＿circ＿0001707对食管鳞癌细胞生物学功能的影响1.在食管鳞癌细胞系EC109,EC9706,KYSE510以及正常食管上皮细胞Het-1A中,应用qRT-PCR检测hsa＿circ＿0001707的表达。数据表明,与Het-1A细胞相比,hsa＿circ＿0001707在鳞癌细胞中表达显着上调（p<0.05）;2.构建含有hsa＿circ＿0001707全长序列的慢病毒表达载体,分别转染至食管鳞癌细胞株EC109及EC9706中,qRT-PCR检测转染效率。结果显示,与空载体对照组（lv-NC）相比,EC109及EC9706细胞中,hsa＿circ＿0001707过表达组（lvcirc-0001707）的表达水平分别提高10倍和40倍,干扰组（sh-circ-0001707）相比于阴性对照（sh-NC）分别被敲低65%和75%（p<0.05）。3.Hsa＿circ＿0001707过表达可以增强细胞活性和增殖能力,促进细胞侵袭和迁移,提高细胞克隆形成能力。CCK-8结果表明,两种细胞中lv-circ-0001707组的吸光度（OD）值在24h,48h,72h和96h时间点时均高于lv-NC组（p<0.05,n=6）;Ed U结果表明,hsa＿circ＿0001707表达上调可明显增强食管鳞癌细胞增殖能力（p<0.05）;Transwell试验证实,高表达的hsa＿circ＿0001707可明显提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力（p<0.05）;平板克隆试验结果显示,与对照组相比,hsa＿circ＿0001707高表达组细胞的克隆形成数量明显增加（p<0.05）。4.当hsa＿circ＿0001707的表达水平受到干扰时,食管鳞癌细胞的活性,增殖能力,克隆形成能力和侵袭迁移能力均显着减弱（p<0.05）。三、Hsa＿circ＿0001707调控食管鳞癌的“分子海绵”机制分析1.荧光原位杂交技术（FISH）结合核质分离试验结果表明,hsa＿circ＿0001707在胞质和胞核中均有分布,但主要存在于细胞质中,提示其发挥功能的主要场所在细胞质;2.Hsa＿circ＿0001707可以ceRNA方式“竞争性吸附”miR-203a-3p:qRT-PCR结果显示,干扰hsa＿circ＿0001707的表达可明显上调miR-203a-3p的表达水平（p<0.05）。构建hsa＿circ＿0001707的野生型（WT）和突变型（MUT）报告基因载体,DLR试验验证两者的相互结合关系。结果表明,hsa＿circ＿0001707（WT）+miR-203a-3p组的荧光值显着减弱,与hsa＿circ＿0001707（WT）+miR-NC组相比,相对降低约37%;与含有hsa＿circ＿0001707突变型质粒组相比,荧光素酶活性降低约41%（p<0.001）。3.细胞挽救实验结果表明,在hsa＿circ＿0001707稳定干扰的两种食管鳞癌细胞株中转染miR-203a-3p inhibitor后,可以部分逆转hsa＿circ＿0001707干扰表达对细胞活性,克隆形成能力及侵袭迁移能力的抑制作用。4.Hsa＿circ＿0001707/miR-203a-3p/Snail2参与调控食管鳞癌细胞的上皮-间充质转化过程:首先,应用公共数据库预测,同时分析TCGA数据库中差异表达mRNA,各组结果取交集,筛选出miR-203a-3p的下游靶基因Snail2。在EC109及EC9706细胞中分别转染miR-203a-3p mimic/NC,western blot及qRT-PCR结果显示,过表达miR-203a-3p可显着抑制Snail2蛋白及mRNA的表达水平（p<0.05）。进一步地,构建Snail2基因的WT及MUT报告基因载体,双荧光素酶报告基因试验结果显示,miR-203a-3p+Snail2（WT）实验组的荧光信号值显着降低,与miRNC+Snail2（WT）组相比,下降约40%;与含有Snail2突变型质粒组相比,下降约48%（p<0.001）。该结果表明miR-203a-3p可与Snail2 3’UTR区域特异性结合。在此基础上,为了进一步验证hsa＿circ＿0001707可与Snail2竞争性结合miR-203a-3p,我们分别在两株食管鳞癌细胞中另设两组进行实验:（1）lv-circ-0001707+Snail2（WT）+miR-203a-3p;（2）lv-NC+Snail2（WT）+miR-203a-3p。结果显示,与第一组相比,EC109中第二组的荧光信号值显着减弱,相对降低约31%。EC9706中第二组的荧光强度相对减弱了27%,差异有统计学意义（p<0.001）。同时,western blot结果显示,hsa＿circ＿0001707敲低表达可导致Snail2基因的表达下降,蛋白水平在EC109和EC9706细胞中分别降低了40%,48%,差异具有统计学意义（p<0.05）。在两株食管鳞癌细胞中分别转染miR-203a-3p mimic/NC,western blot检测EMT关键信号因子的表达。结果显示,与miR-NC组相比,EC109细胞中miR-203a-3p mimic组的E-cadherin蛋白表达水平恢复了30%,而N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下降,相对降低了40%,32%（p<0.05）。在EC9706细胞中,miR-203a-3p mimic组的E-cadherin蛋白表达明显上调,增加了31%。同时,N-cadherin和Vimentin的蛋白水平受到抑制,分别降低了35%,44%（p<0.05）。在两种hsa＿circ＿0001707稳定干扰的食管鳞癌细胞株中,进一步检测EMT通路关键信号因子的表达。结果表明,在EC109细胞中敲低hsa＿circ＿0001707的表达后,可导致N-cadherin和vimentin的表达下降,与空载体组相比,分别下降55%,63%。而上皮型钙粘附蛋白E-cadherin的蛋白水平显着升高,相对恢复了30%（p<0.05）。转染了miR-203a-3p inhibitor后,可以部分逆转这一结果。与shcirc-0001707组相比,E-cadherin的表达水平下调20%,N-cadherin和vimentin的表达水平分别上调27%,29%（p<0.05）。在另一株细胞EC9706中对hsa＿circ＿0001707敲低处理后,与对照组相比,E-cadherin的蛋白水平恢复了35%,N-cadherin和vimentin的蛋白表达降低,分别下降57%,60%（p<0.05）。提示hsa＿circ＿0001707表达下调后可以抑制食管鳞癌细胞的EMT发生。此结果在转染miR-203a-3p inhibitor后得到逆转,相较于sh-circ-0001707组,miR-203a-3p inhibitor组的E-cadherin蛋白表达水平降低了17%,而N-cadherin和vimentin的蛋白表达水平有所恢复,分别升高了20%,17%（p<0.05）。结论:1.Hsa＿circ＿0001707在食管鳞癌组织中表达上调,高表达的hsa＿circ＿0001707可以增加食管鳞癌的发病风险,对于食管鳞癌具有较好的诊断准确性,是潜在的生物标志物。2.Hsa＿circ＿0001707过表达可以提高细胞活性,增强细胞增殖能力,克隆形成能力,促进细胞侵袭迁移。干扰其表达后可以抑制食管癌细胞的恶性表型,表明hsa＿circ＿0001707在食管癌细胞中发挥着癌基因样的作用。3.Hsa＿circ＿0001707可以作为miR-203a-3p的“分子海绵”,间接调控其下游靶基因Snail2的表达。Hsa＿circ＿0001707/miR-203a-3p/Snail2信号通路轴参与调控食管鳞癌细胞的上皮-间充质转化过程。
席树强[10]（2020）在《早晚期肝细胞肝癌中差异表达的长链非编码RNA和mRNA的筛选和生物信息学分析》文中认为背景:肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤,发病率逐年攀升,其中位生存时间为6-20个月,是全世界癌症相关死亡的第三大主要病因。HCC由于其发病率高、侵袭性高、治疗方法有限、总的预后差,目前仍是一个具有挑战性的临床问题。因此,迫切需要寻找潜在的生物标志物,探索HCC发生的分子机制,为HCC的早期预防和诊治提供依据。随着基因组和新的转录测序技术的迅速发展,HCC的相关基因研究越来越受到关注,其中的长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）已经成为HCC研究的焦点,lncRNA是一类大小超过200个核苷酸长度的RNA分子,作为分子研究领域的后起之秀,其在肿瘤中的作用越来越得到重视。近年来的研究表明,许多异常表达lncRNA在肿瘤相关的生物学过程中,如肿瘤的发生、增殖、浸润和转移,起到了非常重要的作用,有望成为是新的潜在的HCC生物标志物。目的:筛选数据库中早期和晚期HCC相关差异表达的lncRNA和mRNA,并进行相关的生物信息学分析,研究lncRNA作为早期HCC和晚期HCC生物标志物的作用。方法:基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库,筛选出在早期HCC、晚期HCC与癌旁正常组织中共有差异表达的mRNA和lncRNA。对与HCC相关的共有差异表达的mRNA和lncRNA,进行基因功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（protein protein interaction net,PPI）网络分析,构建了差异表达基因的分子调控网络。此外,分别对早期HCC和晚期HCC共有差异表达基因进行了lncRNA-mRNA共表达网络构建及分析研究,筛选出差异表达的关键基因。最后,通过定量实时聚合酶链反应（q RT-PCR）对所筛选出的候选基因的差异表达进行验证。结果:与癌旁正常组织比较,在早期HCC和晚期HCC中共筛选出1201个共有差异表达的mRNA和162个共有差异表达的lncRNA。通路富集分析结果显示,细胞周期、p53信号通路、视黄醇代谢通路和细胞色素P450的外源物新陈代谢通路是主要富集的四个通路。根据PPI网络分析的结果,筛选出10个关键基因,分别为CDK1、AURKA、CDC20、PLK1、AURKB、HIST1H2BG、BUB1B、CCNA2、CCNB1、CDT1。而共表达网络结果表明无论在早期HCC还是晚期HCC,CTD-2510F5.4和HAND2-AS1都是hub lncRNA。最终,q RT-PCR的验证结果与我们的整合分析结果一致。结论:确定了4个差异表达的mRNA（CDK1、KIFC1、CENPF和ECM1）和2个差异表达的lncRNA（CTD-2510F5.4和HAND2-AS1）,可作为潜在的诊断HCC及预测预后的新型生物标志物。
二、钙粘附蛋白及其在骨组织形成中的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、钙粘附蛋白及其在骨组织形成中的研究进展（论文提纲范文）
（1）Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞、破骨细胞在骨质疏松中的作用探讨（论文提纲范文）
| 1 Wnt信号通路的组成及细胞内调控机制 |
| 2 对成骨细胞的调控作用 |
| 3 对破骨细胞的调控作用 |
| 4 Wnt信号异常对OP发生发展的作用 |
| 5 小结与展望 |
（2）隔药饼灸治疗内异症miRNAs及PI3K-Akt信号通路的理论和实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 中医对内异症的认识 |
| 1.1 古代文献对内异症的认识 |
| 1.1.1 胞宫生理 |
| 1.1.2 月经生理 |
| 1.1.3 子宫内膜异位症的文献记载 |
| 1.2 子宫内膜异位症的病因病机 |
| 1.3 现代中医名家对内异症的认识 |
| 1.3.1 朱南孙 |
| 1.3.2 夏桂成 |
| 1.3.3 柴嵩岩 |
| 1.3.4 梁瑞宁 |
| 1.3.5 韩延华 |
| 1.3.6 金季玲 |
| 1.4 针灸作用机理的分子细胞生物学研究 |
| 1.4.1 针灸调控miRNA |
| 1.4.2 针灸调控PI3K/Akt信号通路 |
| 2 现代医学对子宫内膜异位症的认识 |
| 2.1 子宫内膜异位症的发病机制 |
| 2.1.1 在位内膜决定论 |
| 2.1.2 免疫调节学说 |
| 2.1.3 菌群失调 |
| 2.2 子宫内膜异位症的流行病学特征 |
| 2.2.1 基因 |
| 2.2.2 遗传/家族史 |
| 2.2.3 体重 |
| 2.2.4 精神心理 |
| 2.2.5 职业性质 |
| 2.2.6 其它 |
| 2.3 miRNA与子宫内膜异位症 |
| 2.3.1 miRNA与细胞粘附、侵袭 |
| 2.3.2 miRNA与细胞生长、增殖 |
| 2.3.3 miRNA与血管形成 |
| 2.4 PI3K/Akt/mTOR信号通路与EMs |
| 第二部分 实验研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 观察指标 |
| 2.2.1 形态学观察 |
| 2.2.2 分子生物学观察 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 small RNA测序技术,筛选差异表达miRNAs |
| 2.3.2 靶基因功能分析 |
| 2.3.3 PCR验证EMs差异表达的miRNA和 mRNA |
| 2.3.4 WB技术检测PI3K-Akt-mTOR信号通路 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 镇痛作用 |
| 2.5.2 生长抑制率 |
| 2.5.3 差异化表达的miRNA |
| 2.5.4 PCR验证各组共同调控的miRNA |
| 2.5.5 靶基因功能分析 |
| 2.5.6 PCR验证靶基因 |
| 2.5.7 WB检测PI3K-Akt-mTOR信号通路 |
| 第三部分 讨论 |
| 3.1 灸法在治疗内异症中的作用 |
| 3.1.1 艾灸调整冲任经气 |
| 3.1.2 中药调整冲任经气 |
| 3.2 腧穴在治疗内异症中的作用 |
| 3.2.1 关元的功效 |
| 3.2.2 关元与冲任的关系 |
| 3.2.3 关元穴作用的原理 |
| 3.3 隔药饼灸与miRNA、信号通路、内异症关系探讨 |
| 3.3.1 miRNA表达 |
| 3.3.2 信号通路 |
| 3.3.3 隔药饼灸的作用机理 |
| 第四部分 不足与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 文献综述 子宫内膜异位症发病机制与治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（3）UBD在哈、维、汉三民族食管鳞癌组织中的表达及临床病理学意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.0 HE 染色 |
| 2.1 免疫组织化学 |
| 2.2 实时荧光定量PCR实验 |
| 3.质量控制 |
| 4.统计学方法 |
| 5.技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 UBD 在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（4）NeuroD1调控CA3介导脊索瘤细胞增殖侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验仪器与试剂耗材 |
| 试剂配制 |
| 第一章 NeuroD1和CA3在脊索瘤细胞中的表达情况 |
| 前言 |
| 一、实验步骤 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 第二章 NeuroD1对CA3基因调控作用的研究 |
| 引言 |
| 一、实验步骤 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 第三章 CA3对脊索瘤增殖和恶性行为的影响 |
| 引言 |
| 一、实验步骤 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊索瘤发病机制研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（5）miR-203a通过靶向Slug调控EMT抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 miR-203a对非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响及其机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 miR-203a靶向Slug调控EMT对非小细胞肺癌A549 细胞迁移和侵袭的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNAs在肺癌中的研究进展和miR-203a的研究概况 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）C5a/C5aRs通过ERK信号通路调控OPN及PD-L1促进乳腺癌发生骨转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、背景介绍 |
| 二、课题实施方案 |
| 参考文献 |
| 第一章 补体激活产物C5a及其受体与乳腺癌发生骨转移的相关性 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第二章 补体激活产物C5a及其受体在乳腺癌发生骨转移相关微环境中的作用 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第三章 C5a/C5aRs调控的下游基因及分子机制 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 全文总结 |
| 综述 补体蛋白在肿瘤骨转移相关微环境中研究进展 |
| 一、补体系统 |
| ㈠、补体系统概述 |
| ㈡、补体系统激活途径 |
| ㈢、补体系统的免疫作用 |
| ㈣、补体系统的非免疫作用 |
| 二、肿瘤的转移 |
| ㈠、肿瘤转移概述 |
| ㈡、肿瘤转移的机制 |
| ㈢、肿瘤骨转移的机制 |
| 三、补体系统在肿瘤转移中的作用 |
| ㈠、补体系统在肿瘤中的作用 |
| ㈡、补体蛋白在肿瘤发生骨转移相关微环境中的作用 |
| 四、抑制补体治疗肿瘤的展望 |
| 参考文献 |
| 参加科研活动和学术成果 |
| 致谢 |
（7）TRB3表达水平通过Wnt/β-catenin信号通路对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型的制备 |
| 2.2 标本收集方法 |
| 2.3 BALF 涂片、染色、细胞分类和计数 |
| 2.4 肺组织HE染色、Masson染色和纤维化评分 |
| 2.5 肺组织羟脯氨酸测定 |
| 2.6 免疫组化检测小鼠肺组织TRB3、EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、α-SMA)的表达情况 |
| 2.7 Westernblot检测各组肺组织中TRB3、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、α-SMA、 β-catenin蛋白的表达 |
| 2.8 RT-q PCR检测肺组织中TRB3、pro CollaⅠ/Ⅲm RNA的表达 |
| 2.9 ELISA检测各组肺组织Col1aⅠ/Ⅲ的含量 |
| 3 统计方法 |
| 实验结果 |
| 1 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化造模结果 |
| 2 外源性调控TRB3的表达对小鼠肺组织纤维化的影响 |
| 3 免疫组化检测小鼠肺组织TRB3、EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、α-SMA)及β-catenin蛋白的表达情况 |
| 4 Western blot检测各组肺组织中TRB3、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、α-SMA、β-catenin蛋白的表达 |
| 5 RT-q PCR检测m RNA水平各组肺组织TRB3、pro CollaⅠ/Ⅲ表达变化 |
| 6 ELISA检测各组小鼠肺组织中CollaⅠ、CollaⅢ的含量 |
| 讨论 |
| 1 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型的制备 |
| 2 TRB3参与小鼠肺纤维化的形成 |
| 3 TRB3对小鼠肺纤维化的影响 |
| 4 Wnt/β-catenin信号通路与肺纤维化 |
| 5 TRB3 表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）食管鳞状细胞癌hsacircRNA6448-14的功能及机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 食管鳞状细胞癌相关CIRCRNA表达谱分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HSA_CIRCRNA6448-14在食管鳞状细胞癌的诊断及临床意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HSA_CIRCRNA6448-14对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 HSA_CIRCRNA6448-14负性调控MIR-455-3P在食管鳞状细胞癌中作用机制的初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 CIRCRNA在食管鳞状细胞癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）Hsa＿circ＿0001707在食管癌发生发展中的功能及其分子海绵机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 Hsa_circ_0001707 与食管鳞状细胞癌发病风险的研究 |
| 引言 |
| 第一节 Hsa_circ_0001707 在食管癌组织中的差异表达研究 |
| 第二节 Hsa_circ_0001707 的环状特性验证 |
| 讨论 |
| 第二章 Hsa_circ_0001707 对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 引言 |
| 第一节 Hsa_circ_0001707 在食管鳞癌相关细胞系中的表达及亚细胞定位分析 |
| 第二节 Hsa_circ_0001707 对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 讨论 |
| 第三章 Hsa_circ_0001707 调控食管鳞状细胞癌的分子海绵机制分析 |
| 引言 |
| 第一节 Hsa_circ_0001707 作为ceRNA的靶miRNA识别 |
| 第二节 Hsa_circ_0001707 可竞争性“吸附”miR-203a-3p |
| 第三节 Hsa_circ_0001707 通过miR-203a-3p参与调控食管鳞癌 |
| 第四节 Hsa_circ_0001707与Snail2 竞争性结合miR-203a-3p |
| 第五节 Hsa_circ_0001707/miR-203a-3p/Snail2 调控食管鳞癌的EMT过程 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 环状RNA的概述及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）早晚期肝细胞肝癌中差异表达的长链非编码RNA和mRNA的筛选和生物信息学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在肝癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、钙粘附蛋白及其在骨组织形成中的研究进展（论文参考文献）
- [1]Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞、破骨细胞在骨质疏松中的作用探讨[J]. 张帆,梁清洋,韩超,刘佳,唐毓金. 中国骨质疏松杂志, 2021(10)
- [2]隔药饼灸治疗内异症miRNAs及PI3K-Akt信号通路的理论和实验研究[D]. 徐鹏. 江西中医药大学, 2021(01)
- [3]UBD在哈、维、汉三民族食管鳞癌组织中的表达及临床病理学意义[D]. 罗枭磊. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]NeuroD1调控CA3介导脊索瘤细胞增殖侵袭的机制研究[D]. 叶琛. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [5]miR-203a通过靶向Slug调控EMT抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的机制研究[D]. 姜全伟. 新乡医学院, 2020(06)
- [6]C5a/C5aRs通过ERK信号通路调控OPN及PD-L1促进乳腺癌发生骨转移的机制研究[D]. 唐亮. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]TRB3表达水平通过Wnt/β-catenin信号通路对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的影响机制[D]. 李阳. 青岛大学, 2020(01)
- [8]食管鳞状细胞癌hsacircRNA6448-14的功能及机制的初步研究[D]. 张耀文. 郑州大学, 2020(02)
- [9]Hsa＿circ＿0001707在食管癌发生发展中的功能及其分子海绵机制研究[D]. 高涵. 东南大学, 2020(01)
- [10]早晚期肝细胞肝癌中差异表达的长链非编码RNA和mRNA的筛选和生物信息学分析[D]. 席树强. 河北医科大学, 2020(02)