一、感音神经性耳聋的细胞生物学研究现状（论文文献综述）
曾友根[1]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究表明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
王新兰,田海月,钟翠萍,向大伟[2]（2020）在《基因与干细胞治疗感音神经性聋的研究现状》文中提出感音神经性聋（sensorineural hearing loss, SNHL）是由耳蜗毛细胞（HCs）和螺旋神经元（spiral ganglion neurons, SGNs）的丢失或损伤引起的,是全世界常见的一种听力损失,影响着数百万人。目前很少有治疗听力损失的方法,因此,有必要开发新的治疗方法来帮助数百万听力障碍患者。近年来,基因与干细胞研究在涉及感音神经的领域取得了巨大进展,这一技术的进步为治疗听力损失的患者提供了一线希望。本综述讨论了利用基因和干细胞疗法替换丢失的感觉和神经细胞来治疗感音神经性听力损失的研究现状,并探讨了当前阻碍其临床应用的可能障碍和局限性。
高松[3]（2020）在《Blebbistatin在抑制新霉素诱导的听觉毛细胞凋亡中的作用及机制研究》文中研究说明目的:2018年WHO的报告表明全球约有4.66亿听力障碍患者。内耳功能异常引起的感音神经性耳聋约占患者人数的90%。遗传因素、老龄化、噪音损害和耳毒性药物的损伤引起的内耳听觉功能异常感音神经性听力损失的主要原因。氨基糖苷类抗生素因其低廉的价格和良好的疗效,在某些疾病临床治疗上成为最常用的一类药物,但由于其导致的氧自由基的积累和对听觉毛细胞凋亡的诱导,这类抗生素具有明确的耳毒性副作用。我们尝试寻找一种能减少或阻止氨基糖苷类抗生素对内耳听觉毛细胞损伤的药物,并进一步探究其作用机制,为药物性耳聋的治疗提供一种可行的思路。方法:本研究选择小分子药物Blebbistatin作为研究对象,氨基糖苷类抗生素选择临床与基础研究中较常用的新霉素进行实验。首先在HEI-OC-1类毛细胞及小鼠内耳毛细胞组织培养模型中,加入了0.5 mM新霉素损伤建立损伤模型,通过CCK-8实验、死活染色、细胞计数等方法探究了Blebbistatin是否能提高氨基糖苷类抗生素诱导后细胞的存活率,并探究Blebbistatin在该损伤模型中最适宜的保护浓度,并以此浓度作为标准进行随后的实验。同样在HEI-OC-1类毛细胞系及小鼠内耳毛细胞的损伤模型中,通过细胞流式分析技术、qPCR检测及免疫荧光染色技术,验证Blebbistatin是否通过抑制细胞凋亡的方式,提高氨基糖苷类抗生素诱导后细胞的存活率。随后通过相同的方法探究Blebbistatin对氨基糖苷类抗生素诱导后HEI-OC-1类毛细胞系及小鼠内耳毛细胞损伤模型中的线粒体膜电位、活性氧的累积以及突触结构的影响。结果:在新霉素暴露后,Blebbistatin可以减少新霉素诱导的两种损伤模型中毛细胞的凋亡,且这种效果在一定剂量范围内,与Blebbistatin的浓度呈正相关。随后的实验结果表明,Blebbistatin维持两种损伤模型中氧化基因和抗氧化基因表达的平衡,稳定了HEI-OC-1类毛细胞和内耳毛细胞的线粒体功能,从而减少了细胞中活性氧的积累,由此抑制了新霉素所诱导的HEI-OC-1类毛细胞及内耳毛细胞的凋亡。同时Blebbistatin维持了毛细胞与螺旋神经元之间的突触结构的完整性,为毛细胞与螺旋神经元之间的通讯提供了必要前提条件。结论:Blebbistatin可以提高新霉素诱导损伤后听觉毛细胞的存活率,其通过保护线粒体功能,减少活性氧积累的方式减少细胞凋亡,作用方式适用于大部分药物毒副作用导致的听力损伤模型中。这些结果表明,Blebbistatin可能在预防氨基糖苷类药物引起的内耳毛细胞损失和药物性耳聋的治疗及预防方面具有潜在的临床应用价值。
董颖[4]（2020）在《新生小鼠耳蜗中Frizzled-9+支持细胞作为内耳前体细胞可以增殖分化并再生毛细胞》文中研究说明感音神经性耳聋是临床上常见的感觉缺陷性疾病之一,主要由遗传、噪声、药物损伤等原因造成,目前认为利用内耳干细胞再生毛细胞是治疗感音神经性耳聋的根本方法。Wnt信号通路下游靶基因Lgr5是内耳干细胞的标记物,Wnt信号能够促进内耳干细胞的增殖分化并再生毛细胞。Frizzled-9（Fzd9）是Wnt信号的受体之一,是大脑中神经元干细胞的标记物和人类胎盘、骨髓间充质干细胞的标记物。目前Fzd9在小鼠耳蜗中的表达和作用尚无研究。因此,我们利用Fzd9-Cre ER转基因小鼠,在新生鼠耳蜗中标记和谱系追踪Fzd9+细胞并对其进行体外培养来研究Fzd9+细胞是否具有内耳干细胞的特性。我们的研究结果显示,在P3新生小鼠耳蜗中,Fzd9只标记了支持细胞中的内指细胞（Inner phalangeal cells）、内边界细胞（Inner border cells）和第三排Deiters细胞（third-row Deiters’cells）,在数量及种类上均比Lgr5标记的细胞更少。随着小鼠年龄的增长,Fzd9表达量逐渐降低,在P14后检测不到表达。我们进一步通过体内谱系追踪实验,发现新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞具有再生毛细胞的能力,并且再生毛细胞的数量与Lgr5+内耳干细胞再生毛细胞的数量没有显着差异。在体外实验中,通过体外培养流式筛选的新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞发现,Fzd9+细胞在体外具有成球和分化为Myo7a+细胞的能力,并且其成球数量和直径以及体外分化能力与Lgr5+内耳干细胞无显着差异。因此,我们的研究证明新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞具有内耳干细胞的特性,在体内和体外均具有再生毛细胞的能力,并且与Lgr5+内耳干细胞增殖分化和再生毛细胞的能力没有显着差异。因此我们认为Fzd9可以作为标记更少支持细胞类型的内耳干细胞的标记物。
桂飞[5]（2019）在《Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用》文中认为目的:耳蜗螺旋神经节（spiral ganglion neurons,SGNs）能够将毛细胞接收到的声音信号传递至听觉中枢并产生听力,其数量和功能对于维持正常听功能具有重要意义。受限于有限的再生能力,SGNs损伤后很难自发再生并恢复原有功能,各种神经营养因子在此过程中发挥重要作用。神经突起生长因子Neuritin是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子,本课题组前期研究发现其在促进毛细胞转分化再生方面具有重要作用,并可保护神经纤维免于毛细胞缺失所致的继发性损伤,说明其在维持SGNs存活及功能方面具有潜在重要作用。基于上述研究基础,本研究旨在利用长爪沙鼠筛选并建立耳蜗螺旋神经节特异性损伤所致的感音神经性耳聋模型,探究其在保护受损耳蜗SGNs,修复受损听神经功能中的作用,为SGNs缺失导致的感音神经性耳聋的防治提供新的研究策略和科学依据。方法:1、取不同发育时期的耳蜗组织,用qPCR和WB方法,从分子水平检测Neuritin的表达变化;冰冻切片后,用免疫荧光法,检测Neuritin的表达定位,明确Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育各阶段的表达变化。2、选择3种耳毒性药物（卡那霉素和呋塞米联用、新霉素、哇巴因）造模,通过ABR检测和组织形态学分析,筛选并鉴定出长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性损伤的耳聋模型,并探究耳聋发生发展过程中Neuritin的表达变化,明确其表达与该耳聋模型的相关性。3、组织水平,建立乳鼠Corti组织的体外培养体系,使用哇巴因损伤SGNs的同时加入不同浓度的Neuritin蛋白,探究其对受损耳蜗SGNs的保护作用。动物水平,利用方法2中确定的损伤模型,经圆窗滴注不同剂量的Neuritin蛋白,通过ABR检测和组织水平分析,综合评价Neuritin对受损听功能的修复效果。结果:1、检测发现,Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段均有表达,胚胎期第20天（E20）表达量较低,出生后1-56天（P1-56）表达持续升高;其表达主要分布于SGNs和Corti器区域。2、不同药物建模结果显示,仅低浓度哇巴因（1mM）可引起耳蜗SGNs特异性缺失,且伴听力阈值显着上升,最终选定此条件进行损伤模型的建立;进一步研究发现,损伤后耳蜗中Neuritin表达下调,表明Neuritin的表达与该模型具有相关性,且呈负相关。3、体外研究显示,Neuritin（16μg/mL）组和Neuritin（32μg/mL）组每100μm2 SGNs的数量分别为13.2±1.2和16±2.6,显着高于损伤组的7.3±2.2;每100μm神经纤维的数量分别为8.2±1.1和11.6±1.5,也显着高于损伤组的4.6±1.1,且排列更为整齐;各组毛细胞均不受影响。动物水平结果显示,在哇巴因损伤的同时经圆窗滴注Neuritin蛋白可促进部分听功能的恢复,表现为Neuritin（16μg）组高频区16kHz和32kHz听力阈值分别为32.5±8.9dB,61.3±3.5 dB,显着低于损伤组的48.3±16.0 dB,85±5.5 dB;Neuritin（32μg）组高频区8kHz、16kHz和32kHz听力阈值分别为25±10.7 dB,31.3±9.9 dB,55±5.3dB,均显着低于损伤组。组织形态学检测显示,Neuritin处理组中耳蜗中底回螺旋神经节细胞及神经纤维的数量较损伤组显着增多,与功能检测的结果一致。结论:1、Neuritin在长爪沙鼠耳蜗发育过程中均有表达,尤其在幼年至成年阶段,且主要表达在耳蜗SGNs及Corti区域;2、低浓度哇巴因（1mM）诱导的长爪沙鼠耳蜗SGNs特异性缺失模型,为本研究选定的最佳动物模型,在该模型中Neuritin的表达与SGNs的损伤呈负相关关系;3、体外和体内研究表明,Neuritin剂量依赖性地维持了受损长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的数量及排列,有效促进了高频损伤区域的听功能恢复。
曾梓豪[6]（2019）在《氧化应激诱导HEI-OC1细胞株凋亡与STATs的相关性研究》文中提出目的噪声性听力损失（noise-induced hearing loss,NIHL）是一种多发的职业病,氧化应激产生的氧自由基（reactive oxygen species,ROS）诱导的细胞凋亡不仅是NIHL耳蜗毛细胞损伤的重要机制,也是多种感音性耳聋的基本病理学基础。JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路,该通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学过程,本研究通过探索氧化应激状态下JAK-STAT信号通路中各STATs因子与毛细胞株HEI-OC1（House Ear Institute-Organ of Corti 1）凋亡的相关性,探讨STATs各因子的生物学作用,为NIHL的防治提供理论依据。方法用含四种不同浓度（0μM、20μM、40μM、60μM）叔丁基过氧化氢（t-BHP）的培养基培养HEI-OC1细胞48 h,构建氧化应激损伤细胞模型;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测氧化应激状态下HEI-OC1细胞中各STATs mRNA的表达水平,根据其在氧化应激状态下STATs mRNA的表达水平及对凋亡的影响,选择特异性表达的STAT因子,并针对该转录因子设计siRNA（small interfering RNA）,通过对该转录因子表达的抑制观察其对HEI-OC1细胞凋亡率及Caspase-3的影响。结果应激状态下HEI-OC1细胞凋亡率随t-BHP染毒浓度的增加而上升,与对照组（凋亡率3.9%）相比,20、40、60μM染毒组的细胞凋亡率分别为7.4%、32.0%、91.2%。实时荧光定量PCR检测STATs mRNA表达水平结果显示与对照组相比STAT1 mRNA的表达水平出现明显下降（F=5534.302,P<0.01）,各染毒组间未见显着性差异（P>0.05）;与对照组相比STAT2 mRNA的表达水平均有明显变化（F=1259.148,P<0.01）,20μM染毒组STAT2 mRNA的表达水平明显下降（P<0.01）,但40、60μM浓度组均出现明显升高（P<0.01）;与对照组相比STAT3 mRNA的表达水平均出现显着下降（F=146.038,P<0.01）,但各染毒组间未见显着差异（P>0.05）;STAT4在HEI-OC1细胞株中未有表达;与对照组相比STAT5 mRNA的表达水平均出现明显下降（F=685.929,P<0.01）,各染毒组间比较无显着差异（P>0.05）;与对照组相比STAT6 mRNA的表达水平均出现明显下降（F=516.11,P<0.01）,各染毒组间未见显着差异（P>0.05）。STAT2 mRNA的表达水平在高浓度染毒组明显具有特异性,设计STAT2的siRNA观察其与HEI-OC1细胞凋亡的关系,与未干扰组细胞凋亡率（对照组0.3%、低浓度组6.7%、中浓度组8.3%、高浓度组12.3%）相比,对STAT2进行siRNA干扰后的HEI-OC1细胞的凋亡率明显上升（对照组1.8%、低浓度组7.4%、中浓度组9.4%、高浓度组14.4%）。Western Blot法检测分析siRNA干扰前后各染毒组STAT2和Caspase-3的表达水平,0μM浓度染毒条件下,干扰后的STAT2表达水平出现显着下降（t=-10.963,P<0.05）,Caspase-3表达水平无明显差异（t=-0.81P>0.05）;20μM浓度染毒条件下,干扰后STAT2表达水平出现显着下降（t=-23.908 P<0.05）,Caspase-3表达水平显着上升（t=9.77 P<0.05）;40μM浓度染毒条件下,干扰后STAT2表达水平出现显着下降（t=-18.657P<0.05）,Caspase-3表达水平显着上升（t=13.619 P<0.05）;60μM浓度染毒条件下,干扰后STAT2表达水平出现显着下降（t=-14.626,P<0.05）,Caspase-3表达水平显着上升（t=17.546 P<0.05）。结论JAK-STAT信号通路在毛细胞氧化应激损伤细胞凋亡的发生过程中具有重要作用,JAK-STAT信号通路中各STAT因子在凋亡中发生的生物学作用不同,JAK-STAT2通路具有抑制毛细胞凋亡作用,推测JAK-STAT1/STAT3/STAT5/STAT6信号通路可能具有促进凋亡的生物学作用,研究结果为NIHL的机制提供了新的观点,STAT2可能成为保护NIHL耳蜗毛细胞的作用靶点。
刘日渊[7]（2016）在《经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究》文中研究说明[目的]培养人脐带间充质干细胞及人诱导多能干细胞,对细胞进行鉴定。对两种细胞进行比较,探讨适用于大量培养以满足体内移植治疗的细胞类型。[方法]使用组织块贴壁法从脐带组织中分离人脐带间充质干细胞。培养、鉴定人脐带间充质干细胞及人诱导多能干细胞,绘制两种细胞的生长曲线,并比较细胞形态。[结果]组织块贴壁法成功分离间充质干细胞,经鉴定其表型CD73（+）,CD105 （+）,CD 31（一）,CD34（-）,符合脐带间充质干细胞特点。诱导多能干细胞NANOG （+）、OCT-4（+）、SOX-2（+）、SSEA-4（+）、TRA-60（+）和TRA-81（+）,符合诱导多能干细胞特点。脐带间充质干细胞呈梭形,以漩涡样排列,其倍增时间约42小时。诱导多能干细胞呈圆形或椭圆形,呈集落生长,其倍增时间约18小时。[结论]人脐带间充质干细胞及诱导多能干细胞增殖速度快,状态稳定,适合用于以移植治疗为目的的大量繁殖。[目的]摸索建立一种在人类感音神经性耳聋大型哺乳动物模型上可行的内耳干细胞移植方法,检测经腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植的人诱导多能干细胞在Mitf基因突变耳聋猪的内耳及全身的分布情况,检测对听性脑干反应阈值的影响。[方法]培养及鉴定人诱导多能干细胞。选择Mitf基因突变的荣昌猪作为神经性耳聋模型的实验对象,移植干细胞的荣昌猪为实验组,单纯注射生理盐水的荣昌猪为对照。将人诱导多能干细胞经蛛网膜下腔注射的途径移植到实验组荣昌猪体内。设置观察期为移植后1天、移植后3天和移植后7天,在移植前和处死前行全身麻醉后测定听性脑干反应阈值。按观察期的时间点处死动物取耳蜗及其他组织。制作冰冻组织切片,行免疫组织荧光染色,用人特异性抗体检测供体细胞。提取蛋白质,使用蛋白印迹法检测移植细胞蛋白的表达。提取RNA,使用RT-PCR法检测供体细胞基因在实验对象体内分布。[结果]经蛛网膜下腔穿刺注射的人诱导多能干细胞在移植后可以在实验对象内耳检出；同过蛋白质印迹法在移植后1天、3天和7天可以在内耳、腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、颈椎段脊髓、延髓、小脑、大脑、心、肝、脾、肺、肾中检出移植细胞的蛋白表达。通过RT-PCR方法移植后1天、3天和7天可以在腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、颈椎段脊髓、延髓、小脑、大脑、心、肝、脾、肺、肾中检出移植细胞的基因表达。在移植前后,Mitf基因突变荣昌猪的听性脑干反应的波形未能引出。[结论]数据表明,可以在内耳及其余脏器中检测出移植细胞的蛋白及基因的表达,移植后Mitf突变耳聋猪的听性脑干反应测听在120 dB SPL未能引出波形,移植后螺旋神经节细胞病变未见继续进展。经腰椎穿刺注射是内耳干细胞移植的新途径,但对耳聋治疗效果有待进一步探索。
胡莹[8]（2016）在《泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影响的实验研究》文中提出目的:目前全世界有3.6亿人患有听力障碍,并且有逐年增加的发病趋势。中医则认为“火”、瘀”是突发性耳聋的主要病因,祖国医学在长期的耳聋诊治临床实践中摸索和积累了丰富的经验,运用清肝泻火法与活血化瘀法结合起来而形成泻火化瘀通窍法治疗突发性耳聋在临床治疗中获得很好的疗效,间接证明了泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI具有多靶点调控的作用,但是作用机制并不明确。研究证明,听力障碍主要是感音神经性聋,由血液循环障碍引起,尤其为耳蜗缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury,IRI）所致。最近的研究表明,耳蜗对内耳血流和氧供应的降低或中断极为敏感,耳蜗内氧自由基生成增多和细胞凋亡等因素,可能会导致耳蜗IRI—内耳结构和功能改变。耳蜗内氧自由基如果生成增多,会引起细胞膜功能的变化、细胞和细胞器功能的损伤。其中氧自由基和脂质过氧化物的降解产物丙二醛（MDA）可干扰蛋白质、糖和核酸的代谢,导致酶的活性下降、核酸的模板功能障碍和组织细胞结构损害;当过氧化物酶不足以清除体内氧自由基时,组织亦出现损伤,因此,氧自由基损伤与机体抗氧化酶活性有关,如过氧化氢酶（CAT）等。综上,CAT、MDA是评价耳蜗IRI的重要指标。研究证明,细胞凋亡是耳蜗IRI的一种主要细胞损伤形式。B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bcl-2）是调控细胞增殖与凋亡状态的基因家族。Bcl-2为主要抗凋亡因子,Bax、Bad、Bak、Bid是促细胞凋亡基因,对Bcl-2产生阻抑作用。Bcl-2高表达时,可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,能够抑制细胞凋亡。Bax高表达时,可形成Bax/Bax同源二聚体,促进细胞凋亡。若Bcl-2/Bax存在失衡,即凋亡和增殖的失衡可导致细胞凋亡加重。因此,耳蜗IRI与Bcl-2/Bax表达相关。凋亡的发生过程可通过内源性及外源性通路发生,它们都可通过激活Caspases使细胞亚结构降解。所以,Caspase是凋亡现象中的关键蛋白酶。在外源性凋亡通路中,Caspase-8参于诱导Caspase-3激活,启动类Caspase级联反应,然后活化执行类Caspase-6等,通过作用于细胞核,切割片层素蛋白,导致核纤层崩解,继而导致染色体凝集,即裂解特异性底物促进细胞凋亡。内源性凋亡通路中Caspase-9属于凋亡起始蛋白,它们剪切一系列的细胞亚结构最终导致细胞死亡。两条凋亡通路是相互独立又是紧密联系的。所以耳蜗IRI中Caspase-6、9是评价细胞凋亡损伤的重要指标。突发性耳聋属中医“暴聋”范畴,祖国医学在长期的临床实践中摸索中积累了丰富的经验,泻火化瘀通窍法在大量的临床研究获得了良好的疗效。本实验利用大鼠耳蜗iri模型,观察泻火化瘀通窍法对耳蜗的过氧化氢酶（cat）和丙二醛（mda）、细胞凋亡相关蛋白bcl-2/bax、bad、bak、bid及其凋亡调控蛋白caspase-6、9、12蛋白表达的影响,从分子水平探讨泻火化瘀通窍法在内耳iri中对耳蜗的保护作用,阐明依据中医“火”、“瘀”致病理论创立的泻火化瘀通窍法对耳蜗iri的调控机制,为其临床应用和作用机制提供实验依据。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法制备大鼠耳蜗缺血再灌注损伤（耳蜗iri）模型。将大鼠分成5组,即空白组、模型组、清肝泻火组、泻火化瘀通窍组、活血化瘀组,每组20只。实验方法:清肝泻火组:造模成功术后12h,予清肝泻火药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。泻火化瘀通窍组:造模成功术后12h,予泻火化瘀通窍药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。活血化瘀组:造模成功术后12h,1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。实验指标:（1）各组大鼠分别于造模后、用药前和用药后7d检测听觉脑干诱发电位abr阈值;（2）用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;（3）利用tba法和可见光法检测耳蜗组织mda及cat含量;（4）实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织bcl-2mrna、baxmrna表达;（5）用westernblot蛋白免疫印迹法检测bcl-2/bax、bad、bak、bid蛋白的表达;（6）实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织caspase-6mrna和caspase-9mrna表达;（7）westernblot法检测caspase-6、caspase-9、caspase-12蛋白的表达。统计学处理:数据用spss18.0软件处理,各组计量数据均以均数加减标准差sx)(?表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析;计数资料采用卡方检验。定义p<0.05为差别有显着性意义。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显着低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组p<0.05。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显着性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组基底膜外毛细胞分布呈三排,排列整齐,分布均匀,无明显缺失;模型组的外毛细胞受损严重,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏、凋亡和坏死;清肝泻火组外毛细胞受损也较严重,排列紊乱,缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现破坏、凋亡以及坏死,活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡,泻火化瘀通窍组及活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤明显。3.耳蜗iri可使耳蜗组织cat活性降低（p<0.05）,泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能增加cat活性（p<0.05）,且泻火化瘀通窍组促进cat活力作用优于活血化瘀组（p<0.05）。4.耳蜗iri可使耳蜗组织mda活性升高（p<0.05）,泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能显着抑制mda活性（p<0.05）。5.耳蜗iri可使耳蜗组织bcl-2mrna的表达量降低（p<0.05）,泻火化瘀通窍组的bcl-2mrna的表达量明显高于模型及清肝泻火组（p<0.05）。6.耳蜗iri可使耳蜗组织baxmrna的表达量升高（p<0.05）,活血化瘀组的baxmrna的表达比模型及清肝泻火组低（p<0.05）;泻火化瘀通窍组的baxmrna的表达则显着低于模型组（p<0.05）。7.模型及清肝泻火组bcl-2蛋白的表达显着低于空白组（p<0.05）;而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组bcl-2蛋白的表达均明显增加（p<0.05）。8.模型及清肝泻火组bax蛋白的表达显着高于空白组（p<0.05）;而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显着抑制bax蛋白蛋白的表达（p<0.05）,泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（p<0.05）。9.耳蜗iri使耳蜗组织caspase-6mrna的表达量升高（p<0.05）,泻火化瘀通窍组caspase-6mrna的表达量明显低于模型组（p<0.05）。10.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-9mrna的表达量升高（p<0.05）,泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型模型及清肝泻火组（p<0.05）,泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（p<0.05）。11.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-12mrna的表达量升高（p<0.05）,泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型组（p<0.05）,泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（p<0.05）。12.模型组caspase-6蛋白的表达显着高于空白组（p<0.05）;而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显着抑制caspase-6蛋白的表达（p<0.05）,泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（p<0.05）。13.模型组Caspase-9蛋白的表达显着高于空白组（P<0.05）;与模型及清肝泻组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显着降低Caspase-9蛋白的表达（P<0.05）。14.模型组Caspase-12蛋白的表达显着高于空白组（P<0.05）;与模型组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显着降低Caspase-12蛋白的表达（P<0.05）,泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（P<0.05）。15.泻火化瘀通窍和活血化瘀组GRP78蛋白低于模型及清肝泻火组（P<0.05）,且泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着（P<0.05）。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显着提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显着增加（P>0.05）,7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.耳蜗IRI使耳蜗组织CAT活性降低,MDA含量升高,是听力受损的主因。5.在耳蜗IRI中,泻火化瘀通窍法显着增加CAT活性、降低MDA活性,从而加强抗脂质过氧化,减少脂质过氧化的作用,即纠正CAT/MDA氧化轴的失衡,改善耳蜗IRI中由膜脂质过氧化反应引发的自由基损伤。6.泻火化瘀通窍法能显着升高耳蜗组织中Bcl-2蛋白的表达、降低Bax蛋白表达,纠正Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡,起到抑制细胞凋亡的作用。7.泻火化瘀通窍法能显着降低耳蜗组织中Caspase 6、Caspase 9及Caspase 12蛋白的表达,通过抑制外源凋亡执行蛋白和内源凋亡启动蛋白表达,阻抑细胞凋亡,从而在内耳IRI中发挥对耳蜗的保护作用。综上所述,本研究阐明泻火化瘀通窍法纠正CAT/MDA氧化轴失衡、Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡、抑制凋亡相关蛋白Caspase-6、Caspase-9、Caspase 12执行凋亡的活性,通过抗细胞氧化应激和凋亡机制,抗耳蜗缺血再灌注损伤,为临床突发性耳聋的诊治提供理论依据。
朱恒涛[9]（2014）在《诱导性多能干细胞正常小鼠耳蜗内移植的实验研究》文中指出研究目的：利用显微注射的方法将诱导性多能干细胞（iPSCs）移植至正常小鼠耳蜗内，观察其分化转归情况，为iPSCs的耳聋治疗提供一定的理论依据和试验基础。研究方法：1.建立稳定的小鼠iPSCs的培养体系，对稳定传代的小鼠iPSCs进行体外鉴定。2.小鼠iPSCs细胞的标记和移植：用CM-Dil染料标记iPSCs，流式细胞仪鉴定标记效率。20只正常6-8周龄SPF级CD-1/ICR鼠随机平均分为A、B两组：A组为试验组，B组为对照组，将左耳定为试验耳，实验组移植CM-Dil标记的iPSCs，对照组移植等体积的DMEM基础培养基。两组均在术前1周和术后1月对小鼠左耳行听性脑干反应（ABR）的检测。3.miPSCs耳蜗移植后分化细胞的鉴定：细胞移植1月后免疫组织荧光染色鉴定移植后的细胞是否表达毛细胞标志物（Myosin Ⅶa、Espin）和神经元细胞标志物（Nestin、Neurofilament-M）。4.miPSCs耳蜗内移植后用HE染色鉴定是否有畸胎瘤形成。结果：1.成功建立了稳定的小鼠iPSCs培养体系。稳定传代的小鼠iPSCs经AP染色鉴定阳性且可形成EBs。2.荧光染料（CM-Dil）对小鼠iPS细胞的标记效率达到96.42%。术前1周，A组、B组ABR反应阈分别为24.50±5.50dB SPL、26.00±6.15dB SPL；A、B两组术前1周的ABR反应阈比较差异无统计学意义（p=0.572＞0.05）。术后1月，A组、B组ABR反应阈分别为70.50±4.97dB SPL、68.00±5.37dB SPL；A、B两组术后1月的ABR反应阈比较差异无统计学意义（p=0.295＞0.05）。A、B两组ABR反应阈术后均较术前高（p值均＜0.05），差异有统计学意义。3.A组小鼠耳蜗的内外淋巴内及蜗轴内均可见CM-Dil标记的小鼠iPSCs，并且部分红色荧光标记的细胞表达毛细胞标志物（Myosin Ⅶa、Espin）和神经元细胞标志物（Nestin、Neurofilament-M）。B组耳蜗内未见有红色荧光表达。4.HE染色鉴定移植miPSCs后耳蜗内可见畸胎瘤形成。结论：1.耳蜗内移植后的小鼠iPSCs可以分化为表达毛细胞标志物的细胞；2.耳蜗内移植后的小鼠iPSCs可以分化为表达神经元标志物的细胞；2.小鼠iPSCs耳蜗内移植后有形成畸胎瘤的可能；4.经圆窗径路耳蜗移植iPSCs短期内不能改善因为损伤导致的小鼠听力下降。
任丽丽[10]（2013）在《白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究》文中研究指明小眼畸形相关转录因子（Mitf）是由Mitf基因编码的一个拥有碱性螺旋-环-螺旋拉链（basic helix-loop-helix zipper，bHLH-Zip）结构的转录因子[1]。Mitf调控着许多细胞的分化，如黑色素细胞，视杯来源的视网膜色素上皮细胞（RPE）以及许多类型的骨髓来源的细胞[2]。根据氨基末端的不同，Mitf包含至少5种基因亚型，每种亚型的启动子以及起始外显子都不同，并且表达在不同的组织中，而Mitf-M特异性表达在黑色素细胞和黑色素瘤细胞中[3-7]。人类的Waardenburg综合征是一种以听觉-色素异常为特点的常染色体显性遗传疾病，占先天性耳聋的2%[8]。按临床特征和遗传标准共分为四种亚型。其中Waardenburg综合征2A型及其严重类型Tietz综合征是由MITF-M基因突变引起的，表现为感音神经性耳聋、虹膜异色和白色额发[9]。尽管大量研究已经证明Mitf-M基因突变将导致神经嵴来源的黑色素细胞缺失，最终产生耳聋等症状，但是Mitf基因对听觉系统的作用及其分子病理机制至今未明[10]。因此，仔细研究此亚型Mitf基因的结构和功能对于耳聋的基因诊断和分子病理机制研究是很重要的。本研究通过建立正常荣昌猪内耳解剖、手术方式以及形态、听功能数据库，发现猪的内耳和人类及其他动物相比在功能和形态上既具有相似性又存在差异，为下一步研究白化耳聋荣昌猪奠定了基础；通过对白化耳聋荣昌猪进行家系构建和基因分析，确定精确的致病基因为Mitf-M基因，使得此耳聋动物家系遗传背景清楚，可以作为耳聋疾病的大型哺乳动物模型应用于耳科领域的研究；利用从胚胎到出生后不同发育阶段的自发突变型白化荣昌猪（Mitf-/-）和正常野生型荣昌猪（Mitf+/+）内耳形态学和听功能的比较分析，发现白化荣昌猪的耳聋是由Mitf-M基因突变导致内耳血管纹病理变化引起的，最终引发血管纹中间细胞消失，内耳钾离子浓度和耳蜗内电位的变化，导致ABR异常，听功能丧失，阐述了Mitf-M基因突变引发耳聋的病理机制。使我们进一步明确了胚胎发育过程中Mitf-M对血管纹和黑色素细胞发生作用的关键时间点和变化规律。这可能也是人类Waardenburg综合征2A型及Tietz综合征所致耳聋症状的原因。为研究人类Waardenburg综合征2A型感音神经性耳聋的早期基因干预治疗、人工听力重建、毛细胞再生等提供了重要的基础数据，为人类Waardenburg综合征2A型耳聋的研究提供了理想的大型哺乳动物模型。本研究的重要发现及其意义：1.首次报道了正常荣昌猪内耳超微结构；2.首次发现了白化荣昌猪的耳聋表型与人类Waardenburg综合征2A型Mitf-M基因突变导致的耳聋表型一致；3.首次报道了Mitf-M基因突变与白化荣昌猪内耳血管纹病理变化的关系；4.揭示了Waardenburg综合征2A型发病的分子病理机制。
二、感音神经性耳聋的细胞生物学研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、感音神经性耳聋的细胞生物学研究现状（论文提纲范文）
（1）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）基因与干细胞治疗感音神经性聋的研究现状（论文提纲范文）
| 1 干细胞治疗SNHL |
| 1.1 干细胞的研究背景 |
| 1.2 干细胞治疗SNHL的研究现状 |
| 2 基因治疗SNHL |
| 2.1 基因疗法的研究背景 |
| 2.2 基因治疗SNHL的研究现状 |
| 3 基因与干细胞治疗SNHL的局限性 |
| 3.1 干细胞治疗SNHL的局限性 |
| 3.2 基因治疗SNHL的局限性 |
| 4 总结与展望 |
（3）Blebbistatin在抑制新霉素诱导的听觉毛细胞凋亡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 听觉传导通路与声音的感知 |
| 1.2 内耳病变与感音神经性耳聋 |
| 1.3 本课题的研究目的与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 基底膜培养 |
| 2.4 CCK-8 细胞活性检测实验 |
| 2.5 免疫荧光染色 |
| 2.6 流式分选 |
| 2.7 RNA提取、逆转录PCR与实时荧光定量qPCR |
| 2.8 数据分析 |
| 2.9 技术路线图 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Blebbistatin治疗可显着提高新霉素损伤后类毛HEI-OC-1 类毛细胞的存活率 |
| 3.2 在体外组织培养中,Blebbistatin处理降低了新霉素诱导的耳蜗毛细胞损伤 |
| 3.3 Blebbistatin处理可显着降低新霉素损伤后HEI-OC-1 类毛细胞的凋亡 |
| 3.4 在体外组织培养中,Blebbistatin处理降低了新霉素诱导的耳蜗毛细胞凋亡 |
| 3.5 Blebbistatin处理可显着恢复新霉素暴露后HEI-OC-1 类毛细胞的线粒体膜电位 |
| 3.6 Blebbistatin处理能显着减轻新霉素损伤后HEI-OC-1 类毛细胞的氧化应激 |
| 3.7 Blebbistatin处理可显着降低耳蜗组织培养中新霉素损伤造成的氧化应激 |
| 3.8 Blebbistatin保护毛细胞和螺旋神经节神经元之间的突触结构 |
| 第四章 结果讨论与未来展望 |
| 4.1 研究结果讨论 |
| 4.2 药物性耳聋防治 |
| 4.3 未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文及参加的课题 |
（4）新生小鼠耳蜗中Frizzled-9+支持细胞作为内耳前体细胞可以增殖分化并再生毛细胞（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 耳的结构 |
| 1.1 耳的重要作用 |
| 1.2 内耳结构和作用 |
| 1.3 支持细胞的类型和作用 |
| 第二节 内耳干细胞的研究现状 |
| 2.1 Lgr5 的结构及作用 |
| 2.2 Lgr5 在耳蜗中的表达 |
| 2.3 Lgr5+内耳干细胞在内耳中再生毛细胞 |
| 第三节 内耳干细胞中重要的信号通路——Wnt信号通路 |
| 3.1 经典的Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.2 不依赖于β-catenin的非经典Wnt信号通路 |
| 3.3 Wnt信号通路在耳蜗中的研究 |
| 第四节 Fzd9 的研究现状 |
| 4.1 Fzd家族蛋白在发育中的重要作用 |
| 4.2 Fzd9 在发育中的重要作用 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因型鉴定 |
| 2.2.2 RNA提取及实时定量PCR |
| 2.2.3 耳蜗内Fzd9+细胞的体内标记和谱系追踪 |
| 2.2.4 免疫荧光染色 |
| 2.2.5 组织冰冻切片实验 |
| 2.2.6 流式细胞筛选 |
| 2.2.7 细胞成球实验 |
| 2.2.8 细胞分化实验 |
| 2.2.9 数据处理和分析 |
| 第三章 实验结果及分析 |
| 第一节 新生小鼠耳蜗中Fzd9 的表达 |
| 第二节 不同年龄小鼠耳蜗中Fzd9 的表达 |
| 第三节 新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞在体内具有再生毛细胞的能力 |
| 第四节 新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞体外培养具有增殖形成细胞球的能力 |
| 第五节 新生小鼠耳蜗Fzd9+细胞体外培养具有分化成Myo7a+细胞的能力 |
| 第六节 小鼠耳蜗Fzd9+细胞随着小鼠年龄增长增殖能力的变化 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（5）Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究的目的及意义 |
| 1.2 国内外研究的现状 |
| 1.3 研究的主要内容 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 引物的设计 |
| 2.4.2 耳蜗样本的制备 |
| 2.4.3 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.4.4 荧光定量PCR检测 |
| 2.4.5 耳蜗冰冻切片的制备 |
| 2.4.6 Neuritin在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中表达免疫组织化学染色检测 |
| 2.4.7 听性脑干反应(ABR)检测 |
| 2.4.8 感音神经性耳聋的建立 |
| 2.4.9 给予外源性Neuritin干预处理方法 |
| 2.4.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组人神经突起神经生长因子在不同发育阶段长爪沙鼠耳蜗中的表达 |
| 3.1.1 Neuritin在长爪沙鼠耳蜗不同发育阶段中的表达 |
| 3.1.2 Neuritin在成年长爪沙鼠耳蜗中免疫荧光染色定位 |
| 3.2 神经性耳聋动物模型的建立及重组人神经突起生长因子在耳聋发展过程中的表达变化 |
| 3.2.1 长爪沙鼠的正常听功能检测 |
| 3.2.2 卡那霉素和呋塞米联用全身给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.3 新霉素经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.4 哇巴因经圆窗局部给药造模后鉴定结果 |
| 3.2.5 哇巴因损伤后长爪沙鼠耳蜗Neurtin的表达变化 |
| 3.3 重组人Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤保护作用的研究 |
| 3.3.1 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体外) |
| 3.3.2 重组人Neuritin对受损耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用(体内) |
| 4 讨论 |
| 4.1 神经营养因子的表达变化 |
| 4.2 特异性SGNs受损的神经性耳聋模型的建立及鉴定 |
| 4.3 Neuritin与哇巴因引起神经性耳聋的相关性 |
| 4.4 重组人Neuritin蛋白量效关系的确立 |
| 4.5 神经营养因子对耳蜗螺旋神经节的保护作用 |
| 4.6 重组人Neuritin对听功能保护作用的探讨 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）氧化应激诱导HEI-OC1细胞株凋亡与STATs的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 氧化应激损伤细胞模型的构建 |
| 2.2.3 qRT-PCR(实时荧光定量逆转录聚合酶链反应)检测STATs mRNA |
| 2.2.4 STAT2的siRNA的合成与验证 |
| 2.2.5 SiRNA抑制STAT2对HEI-OC1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 统计学分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 氧化应激状态下HEI-OC1 细胞的凋亡水平 |
| 3.2 各染毒组STATs mRNA表达水平 |
| 3.3 SiRNA干扰STAT2 对氧化应激HEI-OC1 细胞凋亡率的影响 |
| 3.4 Western Blot法检测分析STAT2和Caspase-3 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 人脐带间充质干细胞和诱导多能干细胞的培养与鉴定 |
| 前言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 泻火化瘀通窍法对缺血再灌注损伤CAT、MDA表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 泻火化瘀通窍法对缺血再灌注损伤大鼠耳蜗组织Caspase6/9/12 及Bcl-2 家族表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）诱导性多能干细胞正常小鼠耳蜗内移植的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验主要试剂的配制 |
| 2.1.4 实验仪器和实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验器材的准备及实验分组 |
| 2.2.2 原代 MEF 的制备、培养和冻存 |
| 2.2.3 MEF 的传代和饲养层细胞的制备 |
| 2.2.4 小鼠 iPSCs 的复苏、传代及冻存 |
| 2.2.5 小鼠 iPSCs 的 AP 染色和拟胚体形成实验 |
| 2.2.6 小鼠 iPSCs 的分离及 CM-Dil 的标记 |
| 2.2.7 标记后小鼠 iPSCs 的耳蜗内移植 |
| 2.2.8 小鼠 ABR 的检测 |
| 2.2.9 移植后的荧光染色检测 |
| 2.9.10 移植 miPSCs 后耳蜗冰冻切片的 HE 染色 |
| 2.3 实验数据统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 制备的原代 MEF 及饲养层细胞的特点 |
| 3.2 小鼠 iPS 细胞的生长特点 |
| 3.3 小鼠 iPS 细胞体外鉴定 AP 染色及 EB 生长特点 |
| 3.4 小鼠 iPS 细胞 CM-Dil 标记及流式细胞学检测结果 |
| 3.5 小鼠术前 1 周和术后 4 周 ABR 检测结果及其统计学分析 |
| 3.6 小鼠 iPS 细胞内耳移植后毛细胞和神经元标志物的表达情况 |
| 3.6.1 iPS 细胞内耳移植后毛细胞标志物免疫荧光染色鉴定结果 |
| 3.6.2 iPS 细胞内耳移植后神经元细胞标志物免疫荧光染色鉴定结果 |
| 3.7 HE 染色鉴定 miPSCs 耳蜗内移植后的成瘤性 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 诱导性多能干细胞的特性 |
| 4.2 诱导性多能干细胞分化为内耳毛细胞和螺旋神经元 |
| 4.3 干细胞示踪的方法 |
| 4.4 经圆窗径路细胞移植对小鼠听力的影响 |
| 4.5 总结和展望 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：实验图片 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 正常荣昌猪的听功能及内耳形态学数据库的建立 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白化荣昌猪耳聋家系的构建和基因定位 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 白化荣昌猪耳聋的病理机制研究 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究结论与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、感音神经性耳聋的细胞生物学研究现状（论文参考文献）
- [1]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [2]基因与干细胞治疗感音神经性聋的研究现状[J]. 王新兰,田海月,钟翠萍,向大伟. 中华耳科学杂志, 2020(02)
- [3]Blebbistatin在抑制新霉素诱导的听觉毛细胞凋亡中的作用及机制研究[D]. 高松. 江苏大学, 2020(02)
- [4]新生小鼠耳蜗中Frizzled-9+支持细胞作为内耳前体细胞可以增殖分化并再生毛细胞[D]. 董颖. 东南大学, 2020(01)
- [5]Neuritin对长爪沙鼠耳蜗螺旋神经节损伤的保护作用[D]. 桂飞. 杭州师范大学, 2019(01)
- [6]氧化应激诱导HEI-OC1细胞株凋亡与STATs的相关性研究[D]. 曾梓豪. 广东药科大学, 2019(02)
- [7]经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究[D]. 刘日渊. 中国人民解放军医学院, 2016(02)
- [8]泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影响的实验研究[D]. 胡莹. 辽宁中医药大学, 2016(01)
- [9]诱导性多能干细胞正常小鼠耳蜗内移植的实验研究[D]. 朱恒涛. 南昌大学, 2014(12)
- [10]白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究[D]. 任丽丽. 中国人民解放军医学院, 2013(08)